一种检测水牛奶中掺假牛奶的引物探针组合物及其应用和检测方法

本发明属于食品安全检测，涉及一种基于rpa-crispr/cas12a检测水牛奶中掺假牛奶的引物探针组合物及其应用和检测方法。

背景技术：

1、随着人民的生活水平逐年提高，特色乳产品因其具有独特的风味、优越的营养价值和较高的消化率，需求量日益增加，但其产量却远低于牛乳。其中水牛乳因其较高的蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质及酪蛋白胶束等高营养价值而受到人们青睐。此外，有研究表明对荷斯坦牛奶过敏人群可以耐受水牛奶。但价格和季节性供应差异导致商家和生产者在利益驱动下，会向水牛乳中进行掺杂其他产品。国际药典委员会的调查报告显示，乳成分掺假相关学术研究排第2，媒体相关报道排第7。牛乳中含有超过30种具有潜在致敏性的蛋白质，也是世界卫生组织认定的过敏性食物之一。掺假产品出现，容易引发一些对牛乳过敏的人群过敏，还涉及某些特殊医疗要求和宗教信仰。特色乳产品掺假日益引起消费者的担忧，降低了消费者对特色乳产品市场的信心，也成为令公众非常担忧的食品安全问题。

2、消费者难以通过特色乳产品的气味、颜色等物理特性来准确判断其真实性，常规检测手段也很难对其进行分辨。目前，针对特色乳产品质量的检测与监督，市场监管或相关部门大多采用实验室自检或委托第三方检测机构进行检测。主要通过检测其不同种属来源的蛋白质、脂肪酸和核酸进行区分。为了避免乳产品变质腐败和微生物的滋生问题，经常需要对乳品进行巴氏杀菌或其他热处理。由于蛋白质分子受热不稳定，导致这些方法在热处理过的乳产品中，鉴别能力下降，因此不适用于经过热处理的乳品物种的鉴别。此外还可以通过气相色谱、质谱等建立脂肪指纹图谱分析脂肪酸含量来鉴别乳产品。但基于蛋白质和脂肪酸的检测技术在检测过程中使用需要借助大型的仪器设备，且操作步骤繁琐，比较费力费时，不能满足乳制品快速鉴别的要求。而核酸作为遗传物质，与蛋白质和脂肪酸相比不仅具有物种特异性，而且结构更加稳定，是鉴定乳产品的理想靶标。

3、针对核酸目前主要采用pcr扩增技术为基础的动物源性成分检测，虽然具有特异性强、操作简便、检测通量高等优点，但需要在同一反应体系中加入多对靶向引物，因此反应条件优化难度大，且复杂的pcr反应体系易导致其引物和模板配对效率差，最终导致体系中不同靶标之间扩增效率存在差异。另外，样本核酸纯化需要采用商业化核酸提取试剂盒来完成，步骤繁琐。上述这些方法局限于实验室，依赖仪器设备和专业操作人员，不能满足现场即时诊断需求。面对特色乳产品掺假鉴定的迫切需求和现有检测方法的局限性，亟需开发特色乳产品掺假的新型快速检测方法。

4、基于规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats，crispr)/crispr相关(crispr-associated，cas)系统具有强特异性和可编程性，除了基因编辑能力外，还显示出成为下一代快速、高灵敏度核酸检测技术的巨大潜力，且易与即时检测设备相结合进行现场检测。但单独的crispr检测灵敏度低，需藕联等温扩增技术提高灵敏度。因此，应用rpa-crispr系统检测水牛奶中掺假牛奶建立快速，便捷的检测平台具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于rpa-crispr/cas12a检测水牛奶中掺假牛奶的引物探针组合物及其应用和检测方法。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种检测水牛奶中掺假牛奶的引物探针组合物，基于rpa-crispr/cas12a检测水牛奶和牛奶等温扩增引物为同一组rpa扩增引物为seq id no.1-2所示碱基序列；

4、用于crispr反应体系中鉴别水牛奶的特异性crrna为seq id no.3所示碱基序列；

5、用于crispr反应体系中鉴别牛奶的特异性crrna为seq id no.4所示碱基序列。

6、上述检测水牛奶中牛奶掺假，是指能准确鉴定出水牛奶的同时并准确鉴定其中是否存在牛奶。选取水牛和奶牛种间特异、种内保守的细胞色素b基因(cyt b)作为靶标设计rpa扩增引物；根据最优等温扩增引物对扩增片段筛选含有pam序列的区域，基于此设计crrna，构建crispr/cas12a反应体系。

7、上述检测水牛奶和奶牛的rpa引物和crrna，所述扩增水牛奶和牛奶靶标的rpa引物为同一组，为seq id no.1-2两条引物组成，一条为正向引物，一条为反向引物；所述检测水牛奶的特异性crrna共一条，为seq id no.3；所述检测牛奶的特异性crrna共一条，为seqid no.4。引物序列信息见表1。

8、表1引物及crrna序列信息

9、

10、

11、检测水牛奶中掺假牛奶的引物探针组合物的应用，所述检测水牛奶中掺假牛奶的引物探针组合物在检测水牛奶中是否有牛奶掺假的应用。

12、一种利用所述引物探针组合物检测水牛奶中掺假牛奶的方法，

13、(1)快速提取待检测样品液态奶dna的核酸；

14、(2)以待测样本的核酸为模板，利用权利要求1所述引物配制rpa扩增反应体系，进行水牛奶和牛奶dna的一管多重扩增；

15、(3)将1.5μl扩增产物加入分别包含权利要求1所述特异性crrna的crispr/cas12a体系中；根据cas12a蛋白对荧光报告探针的切割，实验组反应前后荧光从无到有的变化，检测样本是否为水牛奶及其是否掺假牛奶。

16、所述通过荧光变化判定，若样本为水牛奶，则仅在含水牛奶特异性crrna的检测体系中可观察到荧光信号，若样本含有水牛奶和牛奶成分，则在含牛奶crrna体系和水牛奶crrna体系中均可观察到荧光信号，若样本仅含牛奶，则仅在含牛奶特异性crrna的检测体系中可观察到荧光信号。

17、所述步骤(1)中快速提取液态奶dna的体系包括naoh-edta裂解液、无水乙醇、磁珠；

18、其中，所述naoh-edta裂解液中naoh终浓度为0.5m，edta终浓度为0.1m；

19、所述磁珠为羟基500磁珠。

20、具体为：

21、(1)将400μl液态奶样本与150μl naoh-edta裂解液及10μl磁珠混合后涡旋5min；

22、(2)步骤(1)混合后在磁力架上放置30s进行磁分离弃去上清液；

23、(3)步骤2得到的磁珠中加入200μl无水乙醇，涡旋30s漂洗后放置于磁力架上30s进行磁分离，弃去上清液后开盖晾干5min；

24、(4)在步骤(3)得到的磁珠中加入100μl pbs，涡旋30s洗脱dna后置于磁力架上30s进行磁分离，上清液即为dna溶液，在4℃下保存。

25、所述液态奶为牛奶和水牛奶。

26、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

27、本发明提供了一种基于rpa-crispr的灵敏度高、特异性强、简单快速的水牛奶中掺假牛奶的检测方法。反应在38℃条件下进行，没有复杂的控温和变温需求；本方法采用基于pcr管的两步反应，其中rpa反应时间为20min，crispr反应时间30min，共50min；本发明方法设计的rpa引物，可在同一体系内同时扩增出水牛奶和牛奶的靶标序列，后偶联crispr/cas12a反应体系，实现高灵敏度、强特异性、方便快速的水牛奶中掺假牛奶的检测；进一步，本方法采用naoh-edta裂解液和磁珠进行液态奶中的dna的提取，实现快速简单的样本前处理，使本检测方法更适于现场快速检测水牛奶中的牛奶掺假。

28、本发明提供的上述检测方法可以实现水牛奶中牛奶的灵敏、特异、快速检测。该方法操作简单、可重复性强、灵敏度高、背景干扰低、耗时短、特异性强、环境友好，具有现场检测的潜力。该方法对目标dna的检出限可达到10copies每反应，对水牛奶中掺假牛奶的检出限可达到1％(v/v)。因此本方法能够为水牛奶掺假的现场检测提供新的技术手段。