一种靶向人PDGFRβ的单链抗体及其在CAR-T免疫治疗中的应用

本发明属于生物医药和分子生物学，具体涉及一种靶向人pdgfrβ的单链抗体及其在car-t免疫治疗中的应用。

背景技术：

1、本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、肾脏疾病是严重威胁人类健康的全球重大健康问题，并且随着肥胖、人口老龄化等问题的愈发严重，慢性肾脏疾病患病率高达10％以上。研究表明，预计到本世纪末，慢性肾脏疾病将成为寿命较长国家的第二大死亡原因，且慢性肾脏疾病将成为全球第五大常见死亡原因。肾脏纤维化是各种诱因引起的慢性肾脏疾病中共同的病理特征，该病理变化主要由于成纤维细胞、周细胞和肌成纤维细胞等的活化引发。目前尚无有效可行的治疗手段，治疗肾脏纤维化及逆转肾脏功能缺失等是目前急切解决的肾脏问题。

3、研究表明，成纤维细胞、周细胞和肌成纤维细胞等细胞表面高表达pdgfrβ抗原，通过靶向pdgfrβ抗原清除成纤维细胞、周细胞和肌成纤维细胞等细胞不失为一种有效可行的方式。嵌合抗原受体修饰的t细胞疗法(car-t)在治疗血液肿瘤方面取得了较大的成功，鉴于此，car-t免疫疗法同样适用于非肿瘤性疾病，比如自身免疫比病、纤维化、心血管疾病等。有研究表明靶向fap分子的car-t细胞可有效抑制心肌纤维化疾病，靶向upar分子的car-t细胞可通过清除衰老细胞缓解肝脏纤维化疾病。然而，发明人发现，目前尚无可用来构建car的靶向人pdgfrβ抗原的单链抗体(scfv)。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种靶向人pdgfrβ的单链抗体及其在car-t免疫治疗中的应用。具体的，通过免疫小鼠获得靶向人源pdgfrβ抗原的单链抗体，并构建了靶向人pdgfrβ抗原的二代car，发现该car-t细胞可有效杀伤pdgfrβ抗原阳性的细胞，为car-t治疗以肾脏损伤主要特征的慢性肾脏病和其他纤维化相关疾病奠定基础。基于上述研究成果，从而完成本发明。

2、为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：

3、本发明的第一个方面，提供一种靶向人pdgfrβ的单链抗体(scfv)，所述单链抗体包含单链抗体重链vh和单链抗体轻链vl；其中，所述单链抗体重链vh包含具有如seq idno.1所示的氨基酸序列或其功能性变体；所述单链抗体轻链vl包含具有如seq id no.2所示的氨基酸序列或其功能性变体。

4、本发明中，术语“功能性变体”通常是指包括与其具有基本上相同的功能(例如，可以具备所述单链抗体或嵌合抗原受体的性质)，且与其具有至少85％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或至少100％)的序列一致性的氨基酸序列。在某些具体实施方式中，所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能。

5、进一步的，所述单链抗体重链vh与单链抗体轻链vl可以直接连接或通过连接子(linker)连接；所述连接子可以为(g4s)n，其中，n为正整数，例如，可以是1、2、3、4、5或6等。在某些具体实施方式中，所述n为3。进一步的，(g4s)3氨基酸序列如seq id no.3所示。

6、本发明的第二个方面，提供一种靶向人pdgfrβ的嵌合抗原受体(car)，其至少包含上述靶向人pdgfrβ的单链抗体，所述靶向人pdgfrβ的单链抗体在嵌合抗原受体作为抗原结合结构域使用。

7、进一步的，所述靶向人pdgfrβ的嵌合抗原受体，其是以信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激信号传导域和信号传导结构域串联形成；

8、其中，所述信号肽可引导抗原结合结构域及铰链区转移到细胞膜表面。任意合适的信号肽或信号肽的组合均可实现本发明的目的。在本发明的一个具体实施方式中，所述信号肽可以为cd8信号肽，其氨基酸序列如seq id no.4所示。

9、所述铰链区可以为cd8铰链区，其氨基酸序列如seq id no.5所示。

10、所述跨膜区可以为cd8跨膜区，其氨基酸序列如seq id no.6所示。

11、所述共刺激信号传导域可以为4-1bb共刺激信号传导结构域，其氨基酸序列如seqid no.7所示。

12、所述信号传导结构域可以为cd3ζ信号传导结构域，其氨基酸序列如seq idno.8所示。

13、另外，在上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区之间合适的位置可插入任意肽链作为间隔区，所述肽链可以为寡肽或多肽，在此不做具体限定。

14、根据本发明，所述嵌合抗原受体由cd8信号肽、结合人pdgfrβ抗原的抗原结合结构域(vl-(g4s)3-vh)、cd8铰链区、cd8跨膜区、4-1bb共刺激信号传导结构域和cd3ζ信号传导结构域串联而成。

15、本发明的第三个方面，提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述靶向人pdgfrβ的单链抗体或嵌合抗原受体。

16、本发明的第四个方面，提供一种载体，所述载体包含上述核酸分子。

17、根据本发明，所述载体为病毒载体，所述病毒载体可以为逆转录病毒载体或慢病毒载体；进一步优选为慢病毒载体，所述载体是将编码上述单链抗体或嵌合抗原受体的核酸分子插入病毒中，得到表达上述单链抗体或嵌合抗原受体的重组病毒载体。

18、本发明的第五个方面，提供一种免疫活性细胞，其表达上述任一种单链抗体或嵌合抗原受体；或者，包含编码上述任一种单链抗体或嵌合抗原受体的核酸分子；优选地，所述免疫活性细胞选自：t细胞、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或肥大细胞；其中t细胞是优选的，进一步的，当其表达嵌合抗体受体或包含编码嵌合抗原受体的核酸分子，此时免疫活性细胞即为car-t细胞。

19、本发明的第六个方面，提供制备所述免疫活性细胞(特别是car-t细胞)的方法，其包括：用慢病毒感染t细胞；所述慢病毒是将重组慢病毒载体转染慢病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述重组慢病毒载体为将编码上述嵌合抗原受体的核酸分子插入慢病毒载体中制备获得。

20、本发明的第七个方面，提供一种药物组合物，其包含治疗有效量一种或组合的：上述任一种的单链抗体；上述任一种的嵌合抗原受体；或上述任一种的免疫活性细胞；或上述任一种的核酸分子、载体，或上述任一项所述方法制备获得的产品，以及药学上可接受的载体。

21、本发明的第八个方面，提供上述任一种的单链抗体；上述任一种的嵌合抗原受体；或上述任一种的免疫活性细胞；或上述任一种的核酸分子、载体，或上述任一项所述方法制备获得的产品或药物组合物在制备预防和/或治疗pdgfrβ高表达介导疾病的药物中的用途。

22、具体的，本发明通过研究证实，本发明的pdgfrβcar-t细胞在体外对pdgfrβ+细胞具有较强的杀伤能力，因此所述pdgfrβ高表达介导疾病包括但不限于肾脏疾病、肝脏疾病、心血管疾病以及肿瘤性疾病，特别是纤维化介导的慢性肾脏疾病、肝脏疾病、心血管疾病以及肿瘤性疾病。

23、本发明的第九个方面，提供一种预防和/或治疗pdgfrβ高表达介导疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的上述任一种的单链抗体；上述任一种的嵌合抗原受体；或上述任一种的免疫活性细胞；或上述任一种的核酸分子、载体，或上述任一项所述方法制备获得的产品或药物组合物。

24、本发明的第十个方面，提供了一种试剂盒，其包含上述任一种的单链抗体；上述任一种的嵌合抗原受体；或上述任一种的免疫活性细胞；或上述任一种的核酸分子、载体，或上述任一项所述方法制备获得的产品或药物组合物。

25、本发明的第十一个方面，提供上述任一种的单链抗体；上述任一种的嵌合抗原受体；或上述任一种的免疫活性细胞；或上述任一种的核酸分子、载体，或上述任一项所述方法制备获得的产品、药物组合物或试剂盒在检测pdgfrβ表达或制备检测pdgfrβ表达产品中的应用。

26、具体的，通过定性或定量检测受试者样品中的pdgfrβ的表达，可用于筛查、(辅助)诊断或预测pdgfrβ高表达介导疾病的进展。

27、上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

28、上述技术方案首先通过免疫小鼠获得靶向人源pdgfrβ抗原的scfv序列，在此基础上构建二代car，另外经慢病毒感染得到car-t细胞，该car-t细胞可有效杀伤pdgfrβ抗原阳性的293t细胞。

29、上述技术方案为清除pdgfrβ阳性细胞治疗各种器官纤维化在内的慢性肾脏疾病、肝脏疾病、心血管疾病以及多种肿瘤性疾病提供了一条全新的思路，具有极其诱人的进一步开发的价值和应用的前景。