用重组微生物治疗炎性皮肤疾病的方法和组合物与流程

背景技术：

0、发明背景

1、特应性皮炎(ad)或湿疹是一种慢性的、瘙痒的、炎性皮肤疾病，其影响全世界5-20％的儿童(williams,h.等人.jallergy clin.immunol.1999；103(1pt 1):125-138)，并且在许多成年人中也很普遍。特应性皮炎的流行正在增加，某种形式的特应性皮炎影响11％的美国人口(shaw,t.e.等人.j invest dermatol.2011；131(1):67-73)，或约3500万人，仅在美国就造成50亿美元的直接损失。该疾病的主要特征是干燥的、鳞状的、发痒的皮肤。尽管特应性皮炎在世界范围内的患病率正在上升并且其疾病负担很重，但是很少有针对性的且有效的治疗选择。值得注意的是，最常用的治疗方法包括广泛的非特异性的方案，包括、但不限于皮肤保湿、漂白浴、紫外线治疗、饮食干预、抗微生物药、抗组胺药、全身性免疫调节剂以及局部皮质类固醇的施用(hoare,c.等人.health technol.assess.2000；4(37):1-191)。但是，尽管有这些众多选择，但很少能提供持久的症状缓解，并且特应性皮炎复发在大多数个体中常见。此外，2013年国家卫生与健康调查揭示，特应性皮炎患者承受了显著的相关负担，与非特应性皮炎患者相比，他们报告了更高水平的健康护理资源(健康护理提供者/er就诊)、更低的健康相关的生活质量和几乎两倍的工作生产力损失。此外，特应性皮炎患者具有显著更高的变态反应(46％相对于20％)、哮喘(22％相对于8％)、焦虑(43％相对于21％)和抑郁症(37％相对于21％)患病率(whiteley,j.等人.currentmedical research and opinion.2016:1-32)。因此，考虑到特应性皮炎给我们的健康护理系统带来的巨大负担，存在大量未得到满足的需求。

2、最近的研究已经阐明了特应性皮炎的病理生理学，并已经揭示了皮肤屏障缺陷在许多情况下是特应性皮炎发作的主要原因，这导致经皮失水(tewl或twl)以及增加的抗原和病原体暴露。同时，特应性皮炎经常特征在于生态失调(或微生物失衡，其严重程度与疾病严重程度相关；参见kong,h.h.等人.genome research.2012；22(5):850-859；和图1)(这是特应性皮炎的一个显著特征)和皮肤微生物组的多样性缺乏，在特应性皮炎发作和未经治疗的皮肤中，金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)占主导地位。最后，在病灶和非病灶皮肤中存在激活的炎性应答，其尤其由il-4/il-13引起，具有主要的t辅助细胞2型特性(th2)，指示向th2-加权特性的系统转换(sidbury,r.等人.current allergy and asthmareports.2017；17(7):42)。因此，理想的特应性皮炎治疗应同时解决所有这些根本原因，即皮肤屏障缺乏、生态失调和激活的皮肤免疫应答。本发明解决了这些原因。

3、经工程改造的益生菌是一种基于利用皮肤微生物组进行治疗的新颖方案。值得注意的是，经工程改造的益生菌与其它药物递送方法相比具有重要的优点，因为它将在患者的皮肤上建立驻留，并连续地且稳定地原位递送治疗性蛋白。此外，表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis,se)的某些菌株已经表现出对皮肤的重要有益免疫调节作用和抗病原作用，它们与特应性皮炎疾病表型和严重程度有关。此外，由于丝聚合蛋白在皮肤屏障中的作用以及减少经皮失水和改善皮肤水合作用的能力，丝聚合蛋白(其为从丝聚合蛋白原衍生出的结构蛋白)的递送进一步增强了治疗方案。本发明具有以下惊人的优点：提供了使用遗传工程改造的表皮葡萄球菌重组菌株作为皮肤药物递送系统来治疗皮肤疾病(例如特应性皮炎)的方法和组合物(例如，azt-01)，所述皮肤药物递送系统分泌人丝聚合蛋白以解决特应性皮炎的病理生理学。一旦应用于皮肤，对皮肤的稳定定居以及随后丝聚合蛋白的原位分泌可以解决该疾病。本发明的益处包括它作为非甾体类治疗选择的安全性，它由于本发明的丝聚合蛋白分泌的益处与表皮葡萄球菌的局部应用的益处的组合而产生的效力，以及它在甚至低应用频率下(不超过每天1次)在治疗上有效的能力。

4、因此，本发明解决了对炎性皮肤疾病(诸如特应性皮炎)的有效治疗的长期寻找的需求。本发明还是首次报道的共生皮肤细菌的证明之一，所述共生皮肤细菌可以分泌治疗性蛋白质来治疗皮肤疾病。

技术实现思路

1、本发明涉及用于治疗炎性皮肤疾病的方法和组合物，其包含经工程改造的微生物作为活性成分，所述微生物能够表达治疗上有关的重组融合多肽(即蛋白、肽或氨基酸)。

2、在第一方面，本发明表征了能够分泌多肽的重组微生物，其中所述重组微生物包含含有第一编码序列和第二编码序列的表达载体，所述第一编码序列包含能够表达所述多肽的基因，所述第二编码序列包含能够表达细胞穿透肽的基因。在一个有关的实施方案中，所述重组微生物进一步包含含有能够表达输出信号的基因的第三编码序列。在另一个实施方案中，所述第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列的表达是在启动子的控制下。在其它实施方案中，所述第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列的排列是在框架内。在另一个有关的实施方案中，所述第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列可操作地连接至启动子。在一个实施方案中，所述重组微生物是细菌或细菌的组合。在另一个实施方案中，所述多肽是丝聚合蛋白或其变体。在其它实施方案中，所述微生物选自双歧杆菌属(bifidobacterium)、短杆菌属(brevibacterium)、丙酸杆菌属(propionibacterium)、乳球菌属(lactococcus)、链球菌属(streptococcus)、葡萄球菌属(staphylococcus)、乳杆菌属(lactobacillus)、肠球菌属(enterococcus)、片球菌属(pediococcus)、明串珠菌属(leuconostoc)或酒球菌属(oenococcus)或它们的组合。在其它实施方案中，所述重组微生物是表皮葡萄球菌。在另一个实施方案中，所述微生物分泌丝聚合蛋白融合蛋白。在一个实施方案中，所述多肽包含选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seqid no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽与seq id no:1具有至少约80％、81％、82％、83、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与seq id no:2具有至少约80％、81％、82％、83、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与seq id no:3具有至少约80％、81％、82％、83、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与seq id no:4具有至少约80％、81％、82％、83、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与seq idno:5具有至少约80％、81％、82％、83、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与seq id no:6具有至少约80％、81％、82％、83、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与seq id no:7具有至少约80％、81％、82％、83、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与seq id no:8具有至少约80％、81％、82％、83、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一个实施方案中，所述多肽与seq id no:9具有至少约80％、81％、82％、83、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

3、在另一个方面，本发明表征了一种用于生产活生物治疗组合物的方法，所述方法包括：(a)用以下序列转染细胞：(i)第一编码序列，其包含能够表达治疗性多肽的核酸序列，和(ii)第二编码序列，其包含能够表达细胞穿透肽的核酸序列；和(b)使所述转染的细胞产生治疗性多肽融合蛋白；和(c)得到所述活生物治疗组合物。在一个有关的实施方案中，所述方法还包括：(iii)用第三编码序列转染所述细胞，所述第三编码序列包含能够表达输出信号的核酸序列。在另一个实施方案中，所述第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列排列在单个质粒中。在另一个实施方案中，所述第一编码序列、第二编码序列和第三编码序列的排列可操作地连接至启动子。在其它实施方案中，所述细胞选自，其中所述微生物选自双歧杆菌属、短杆菌属、丙酸杆菌属、乳球菌属、链球菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、肠球菌属、片球菌属、明串珠菌属或酒球菌属或它们的组合。在另一个实施方案中，所述细胞是表皮葡萄球菌。在其它实施方案中，所述治疗性多肽融合蛋白是丝聚合蛋白融合蛋白或其变体。

4、在另一个方面，本发明表征了包含核酸序列的核酸，所述核酸序列编码本文任一个方面或实施方案所述的多肽。

5、在另一个方面，本发明表征了通过本文公开或描述的方法中的任一种得到的组合物。在一个有关的实施方案中，所述组合物包含药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体选自水溶液、乳剂、乳膏剂、洗剂、凝胶或软膏剂。

6、在另一个方面，本发明表征了包含重组微生物的活生物治疗组合物，其中所述重组微生物包含(i)第一编码序列，其包含能够表达治疗性多肽的核酸序列；(ii)第二编码序列，其包含能够表达细胞穿透肽的核酸序列；(iii)第三编码序列，其包含能够表达输出信号的核酸序列；和(iiv)启动子，其可操作地连接至所述第一编码序列、所述第二编码序列和所述第三编码序列；其中所述第一编码序列、第二编码序列和第一编码序列能够表达丝聚合蛋白融合产物或其变体。在一个有关的实施方案中，所述重组微生物是表皮葡萄球菌。在另一个实施方案中，所述输出信号将所述丝聚合蛋白融合产物或其变体输出所述重组微生物。在另一个实施方案中，所述细胞穿透肽促进所述丝聚合蛋白融合产物或其变体进入人角质形成细胞。在另一个实施方案中，所述组合物包含药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体选自水溶液、乳剂、乳膏剂、洗剂、凝胶或软膏剂。

7、在另一个方面，本发明表征了一种试剂盒，其包含本文公开或描述的组合物中的任一种和使用说明书。

8、在另一个方面，本发明表征了一种治疗皮肤疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用本文公开或描述的组合物中的任一种的组合物。在另一个实施方案中，所述皮肤疾病是特应性皮炎。