防治溃疡病的枝穗霉属菌株及其发酵培养方法和生防制剂与流程

本发明涉及防治植物病害的生防菌株，尤其涉及防治溃疡病的枝穗霉属菌株及其发酵培养方法和生防制剂，属于杨树溃疡病的生防领域。

背景技术：

1、杨树(populus l.)是杨柳科(salicaceae)杨属(populus)的植物，因其具有适应性强、易生长、丰产丰收等特点，随着杨树栽植面积的不断扩大，杨树上病虫日益严重，限制了杨树的发展。目前，杨树上病害共300余种，包括溃疡类病害、褐斑病、炭疽病、锈病等，其中溃疡病是危害杨树的主要病害之一。杨树溃疡病广泛分布于杨树栽培地区，主要为害主干和枝干，幼林受害较重，常致幼苗死亡，严重影响造林成活率，发病率严重时可达80％以上，是制约杨树林业可持续发展的主要问题之一。同时杨树在水土流失、防风防沙、生态修复等方面均有重要作用，故杨树溃疡病还会对生态系统的稳定性和功能产生不可忽视的影响。因此对杨树溃疡病的防治工作尤为重要。

2、杨树溃疡病的生物防治主要通过生防菌与病原菌之间的互作，从而达到抑制病害发生的作用。拮抗菌的防治机制多样，除了直接抑菌病菌，还能诱发植物抗性。虽然杨树溃疡病的生物防治一直有相应的报道，但多停留在菌株的筛选，很少有生防菌实际应用到生产中，开发和利用枝穗霉属菌株重寄生杨树溃疡病菌作用防治杨树溃疡病十分必要。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供防治植物溃疡病的生防菌株；

2、本发明的目的之二是提供该生防菌株的发酵培养方法；

3、本发明的目的之三是提供该生防菌株的生防制剂。

4、本发明的上述目的主要是通过以下技术方案来实现的：

5、本发明的一方面是提供了防治溃疡病的类淡黄枝穗霉菌株(fpyf6005)，其微生物保藏编号为cgmcc no.41227；其分类命名是：clonostachys pseudochroleuca；保藏时间是：2024年5月14日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

6、本发明的另一方面是提供了微生物保藏编号为cgmcc no.41227的类淡黄枝穗霉菌株(fpyf6005)的发酵培养方法，包括：(1)向固体发酵基础培养基中加入水灭菌得到用于发酵类淡黄枝穗霉菌株的发酵培养基；(2)将微生物保藏编号为cgmcc no.41227的类淡黄枝穗霉菌株的种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养。

7、本发明的一种优选的具体实施方案，所述的固体发酵基础培养基的固体基质由麦麸和玉米粉组成；优选的，按照质量比计，麦麸和玉米粉的比例为(1-3)：(1-5)；更优选的，麦麸和玉米粉的比例为3：2。

8、本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(1)中发酵培养基中的含水量为40-90％，优选为60％。

9、本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(1)中将发酵培养基的初始ph调为5-9；更优选的，步骤(1)中将发酵培养基的初始ph调为5。

10、本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(2)中将微生物保藏编号为cgmccno.41227的类淡黄枝穗霉菌株的种子液按照发酵培养基质量的5％-25％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养；更优选的，将微生物保藏编号为cgmcc no.41227的类淡黄枝穗霉菌株的种子液按照发酵培养基质量的18％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养。

11、本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(2)中所述的发酵培养的温度为20℃-30℃，更优选为30℃；所述的发酵培养的时间为7-12天，优选为10天。

12、本发明还提供了一种防治杨树溃疡病的农药组合物，由微生物保藏编号为cgmccno.41227的类淡黄枝穗霉菌株为活性成分以及农药上可接受的辅料或载体组成。

13、本领域技术人员可以按照生防菌剂的常规制备方法在本发明农药组合物基础上加入生防农药制剂上可接受的辅料或载体，按照农药制剂的常规方法可制备成各种农药剂型，譬如：可湿性粉剂、悬浮剂、水分散粒剂、微乳剂、水乳剂、油悬剂、乳油等剂型，这些农药剂型的制备方法为本领域技术人员所熟知。

14、本发明所述的辅料或载体，如乳化剂、润湿分散剂、增稠剂、防冻剂、稳定剂、防腐剂、崩解剂、粘结剂或填料等，均可以是农药制剂中常规的组分。

15、本发明的一种优选的具体实施方案，本发明提供了防治杨树溃疡病的可湿性粉剂，包括以下各组分：微生物保藏编号为cgmcc no.41227的类淡黄枝穗霉菌株的孢子粉、载体、分散剂、润湿剂和紫外保护剂；优选的，按照质量比计，各组分的用量为：微生物保藏编号为cgmcc no.41227的类淡黄枝穗霉菌株的孢子粉5-20％，润湿剂和分散剂组成的混合物总量为2-15％，紫外保护剂0.1-0.5％，余量为载体；最优选的，各组分的用量为：微生物保藏编号为cgmcc no.41227的类淡黄枝穗霉菌株的孢子粉10％，润湿剂和分散剂组成的混合物总量为10％，紫外保护剂0.3％，余量为载体。

16、其中，按照质量比计，润湿剂和分散剂的比例为(1-9)：(1-9)；优选的，润湿剂和分散剂的比例为9：1。

17、其中，所述的载体选自海泡石或膨润土。

18、所述的润湿剂选取三聚磷酸钠或羧甲基纤维素钠；所述的分散剂选自拉开粉或木质素磺酸钙；进一步优选的，所述的润湿剂是三聚磷酸钠；所述的分散剂是木质素磺酸钙。

19、所述的紫外保护剂优选为荧光增白剂、荧光素钠或纳米氧化锌，最优选为荧光素钠。

20、本发明进一步的提供了一种制备所述防治杨树溃疡病的可湿性粉剂的方法，包括：将微生物保藏编号为cgmcc no.41227的类淡黄枝穗霉菌株的孢子粉以及载体粉碎过筛后与分散剂、润湿剂以及紫外保护剂混合均匀，即得可湿性粉剂。

21、本发明的一种优选的实施方案，将微生物保藏编号为cgmcc no.41227的类淡黄枝穗霉菌株的孢子粉以及载体粉碎过300目筛后与分散剂、润湿剂以及紫外保护剂混合均匀。

22、本发明整体技术方案详述

23、(一)为挖掘控制杨树溃疡病的生防资源，本发明从植物内部分离得7株具有很强生防潜力的枝穗霉属菌株，将这7株枝穗霉属菌经过形态学观察和分子鉴定，确定菌株与clonostachys pseudochroleuca近缘。首先对供试生防菌株的生物学特性进行研究，明确了各菌株生长、产孢量与孢子萌发等特性的区别，在评估当中，所有菌株的孢子抗性及萌发情况均能满足生防菌株的要求。通过平板抑菌和菌株代谢产物发酵滤液的抑菌结果来看，枝穗霉属菌对溃疡病病原真菌的抑制作用主要体现在寄生作用上，随时间推移能完全寄生并致死溃疡原菌；发酵滤液也存在对病原菌v.sordida有抑制作用，但抑制作用十分有限。以对真菌的抑菌实验为主要依据，筛选出生防效果较好的一批菌株为fpyf6004、fpyf6016、fpyf6005、fpyf6003、fpyf6006，进行后续防效试验的验证。首先在排除对杨树致病性问题的基础上，对菌株进行了防效的实验，结果表明各菌株均有较好的防效。结合前期生物学特性差异，发现菌株fpyf6005在生长速度，最高产孢量，孢子活性等方面有较优的效果，最终选取fpyf6005作为目标生防菌株。对fpyf6005菌株的生物学特性进行进一步探究，发现该菌株最适生长温度在28℃，最适宜生长ph值为5，最适宜生长的碳源为蔗糖和可溶性淀粉，碳源为硝酸钠。

24、(二)本发明选取了麦麸与玉米粉作为固体发酵的基质，选取原料和条件后进行单因素试验。在单因素试验的基础上，通过设计p-b试验对关键因子进行筛选，结果关键因子包括接种量、麦麸含量和温度，其中接种量和麦麸含量对产孢量具有显著的影响。接种量适中孢子产量更高，分析原因接种量过少影响生长速度，过多在小瓶中的发酵空间有限，且接种量也会提高水分含量，在后续扩大试验可以提高接种液浓度以减少水分含量的影响；当麦麸含量偏多时孢子产量偏高，麦麸吸水性更强，能在保证含水量的同时又能使发酵基质更松散，更利于孢子接触，也有更好的通气性；在温度的选取方面依据在前期对该fpyf6005菌株的最适生长和产孢温度而定，在25～30℃间，该fpyf6005菌株均能很好的生长，导致在p-b试验中温度的影响不显著。通过p-b试验接种进行响应面b-b试验的设计和分析，b-b试验各因素对产孢量的影响大小同p-b试验中接种量＞麦麸含量＞温度，接种量和麦麸对产孢量有显著影响，温度对产孢量的影响不显著，在绘制的响应面分析图中也表现了各因素相互间交互影响不显著。得到回归模型和方程，数据表明该模型显著，能用于预测结果，最终得到最优培养基和培养条件。优化后预测分生孢子的最大值为每克培养基含1.672×1010个，该产量有利于进行枝穗霉属菌剂的制备。本发明通过响应面法进行枝穗霉属菌固体发酵的优化，得到优化后的固体发酵培养基优化后固体发酵培养基组成为麦麸:玉米粉为3:2；优化后的固体发酵培养条件为：初始ph为7、含水量为60％，种子液接种量为18％，发酵温度为30℃，发酵天数为10d，此条件下产孢量1.672×1010个/g。

25、(三)活体微生物在受到加工条件和环境因素的影响后可能会失活，因此要充分考虑菌株与载体和助剂间的生物相容性。本发明通过生物相容性对载体、润湿剂、分散剂进行了初步的筛选，确定了对fpyf6005菌株生长友好的载体膨润土和一些助剂，再通过助剂对制剂质量的影响，最终筛选助剂为三聚磷酸钠和木质素磺酸钙，最后不断优化助剂加入的比例，从而进行配方的优化以及紫外保护剂的确定，最终优化得到可湿性粉剂配方：孢子粉10％、三聚磷酸钠9％、木质素磺酸钙1％、荧光素钠0.3％，其余使用载体膨润土补齐至100％。该配方对菌株自身的影响较小，能使菌株发挥较好的作用。对制得的制剂进行质量的检测，润湿时间为38s小于标准1min、悬浮率为82％大于标准悬浮液70％、孢子含量大于1×109cuf/g，可过300目筛，结果表明可湿性粉剂的性能符合标准。

26、综上，为挖掘控制杨树溃疡病的生防资源，本发明从植物内部分离获得多株具有很强生防潜力的枝穗霉属菌株，通过形态学观察和分鉴定，确定了菌株的分类地位。通过生物学特性和抑菌试验，从中筛选出符合生防应用的最优菌株并证实其作用。通过响应面法优化菌株的发酵条件，减少成本缩短发酵时间得到含孢量较高的孢子粉；进行了生防菌剂的制备，为工业化生产枝穗霉属菌生防制剂提供参数。