一种利用子叶在蜡梅中进行VIGS基因沉默的方法

本发明涉及一种在蜡梅中进行vigs基因沉默的方法，具体涉及一种利用子叶在蜡梅中进行vigs基因沉默的方法。

背景技术：

1、病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,vigs)最早用于描述植物受病毒侵染后的症状恢复现象。近年来vigs已专门用于指通过重组病毒来沉默植物内源基因的反向遗传学技术。此技术是转录后基因沉默rna的一种表现，是利用携带目的基因cdna片段的病毒载体侵染植株，随着病毒的复制和转录而特异性地诱导序列同源基因mrna降解或被甲基化等修饰，从而引起植物表型或生理指标变化，实现对该功能基因的鉴定。vigs技术不需要遗传转化体系或突变体材料，操作简单，具有速度快、成本低和高通量等优势，因而成为功能基因组学研究领域最具吸引力的技术手段之一。

2、vigs病毒载体有多种，例如：大麦条纹花叶病毒(barley stripe mosaic virus,bsmv)，黄瓜花叶病毒(cucumbermosaic virus,cmv)，水稻东格鲁杆状病毒(rice tungrobacilliform virus,rtbv)和烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,trv)等。其中，烟草脆裂病毒(trv)诱导的基因沉默(trv-vigs)，具有病毒症状温和，持续时间长和沉默效率高等特点。现有文献1(齐希梁,李明,刘聪利,等.trv介导欧洲甜樱桃果实vigs体系的建立[j].果树学报,2018,35(11):1309-1315.doi:10.13925/j.cnki.gsxb.20180188)以欧洲甜樱桃栽培品种‘布鲁克斯’为材料，构建烟草脆裂病毒(trv)介导基因沉默表达载体ptrv2-ans，采用注射压迫法侵染欧洲甜樱桃果实，农杆菌侵染28d后果实的着色表现出缺陷。文献2(付偲僮,司未佳,刘颖,等.trv介导的小报春基因沉默技术体系的建立[j].生物技术通报,2022,38(04):295-302.doi:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2021-0924)以小报春新品种‘红星’为材料，利用小报春的pds(八氢番茄红素脱氢酶)基因作为标记基因，构建了pfpds-trv2载体，通过注射法侵染叶片，在侵染16后开始出现白化表型。文献3(刘桂伶,徐诺,史恭发,等.trv介导的溪荪vigs转化体系的构建与鉴定[j].植物研究,2024,44(01):132-138)以单子叶植物溪荪(iris sanguinea)为材料，克隆ispds基因的特异性片段并构建其vigs重组载体ptrv2-ispds，通过注射法侵染溪荪叶片，侵染14d左右后会出现明显的白化表型。

3、然而现有技术通常选取的植物器官是叶片或果实，且通常以pds(八氢番茄红素脱氢酶)基因为报告基因，缺少其他可用于基因功能验证的报告基因，更没有在蜡梅中成功使用vigs技术实现高效的基因沉默，导致进行本源的基因功能验证存在许多困难。因此，建立蜡梅的vigs体系对后续开展相关基因的功能研究十分重要。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种利用子叶在蜡梅中进行vigs基因沉默的方法，解决了现有技术没有在蜡梅中成功使用vigs技术实现高效的基因沉默的问题，首次实现vigs技术在蜡梅子叶中的应用，为蜡梅的基因功能验证提供了方便快捷的方法。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种利用子叶在蜡梅中进行vigs基因沉默的方法，该方法包含：

3、(1)将trv2-cpchld载体转入大肠杆菌的感受态中，挑取阳性菌株，经pcr鉴定，提取含有trv2-cpchld载体的重组质粒，将含有trv2-cpchld载体的重组质粒转入农杆菌gv3101中，得到含有trv2-cpchld的农杆菌gv3101；

4、(2)将含有trv1的农杆菌gv3101和trv2-cpchld的农杆菌gv3101分别接种到含卡那霉素和利福平的lb液体培养基上，于28℃、200r·min-1下活化培养，于20℃离心收集菌体，弃上清液后用重悬液重悬菌体，分别得到含有trv1的重悬菌液和含有trv2-cpchld的重悬菌液；

5、(3)将含有trv1的重悬菌液和含有trv2-cpchld的重悬菌液，于室温、避光下静置得到注射液；在蜡梅的子叶、幼叶和成熟叶的背面划出伤口，在伤口处将注射液注入，先置于避光、室温下培养，再置于20～25℃培养。

6、优选地，在步骤(2)中，所述接种是将400ul的含有trv2-cpchld的农杆菌gv3101接种到10ml的含卡那霉素和利福平的lb液体培养基；所述卡那霉素的浓度为100mg·l-1，所述利福平的浓度为50mg·l-1。

7、优选地，在步骤(2)中，所述重悬液的成分为mgcl2、脂肪酸甲酯磺酸盐mes和乙酰丁香酮as；所述mgcl2、脂肪酸甲酯磺酸盐mes和乙酰丁香酮as的浓度分别为10mmol·l-1、10mmol·l-1和100mmol·l-1，所述重悬液的ph为5.7。

8、优选地，在步骤(2)中，所述含有trv2-cpchld的重悬菌液的od600为0.4～0.6、0.8～1.0、1.2～1.5或1.8～2.0。

9、更优选地，所述含有trv2-cpchld的重悬菌液的od600为1.2～1.5。

10、优选地，在步骤(3)中，所述混合是将含有trv1的重悬菌液和含有trv2-cpchld的重悬菌液按体积比1∶1混合。

11、优选地，在步骤(3)中，所述伤口的长为2～3mm，所述于避光、室温下培养的时间为24h。

12、本发明提供了一种如所述的方法中所述的trv2-cpchld载体，所述的trv2-cpchld载体的核苷酸序列如seq id no.1所示。

13、本发明提供了一种如所述的方法中所述的重组质粒，所述重组质粒是由如seq idno.1所示的核苷酸序列转入大肠杆菌的感受态中得到的。

14、本发明提供了一种如所述的方法中所述的含有trv2-cpchld的农杆菌gv3101在鉴定叶绿素生物合成相关基因cpchld中的应用。

15、本发明的利用子叶在蜡梅中进行vigs基因沉默的方法，解决了现有技术没有在蜡梅中成功使用vigs技术实现高效的基因沉默的问题，具有以下优点：

16、1、本发明首次实现vigs技术在蜡梅中的应用，用于注射侵染的植物器官是蜡梅的子叶，而不是其他植物中常使用的真叶等器官，这可能与物种的特异性和生理结构有关。

17、2、本发明用于注射侵染的农杆菌菌液od600以1.2～1.5为最佳。

18、3、本发明所用的报告基因是(镁螯合酶d亚基cpchld)基因，有别于pds基因被沉默后植物器官变白的表型，cpchld被沉默后会导致植物器官失绿变黄的表型，因此，其可以专一地用于鉴定与叶绿素生物合成相关的cpchld基因，同时也可以作为一种新的、不同于pds的报告基因。