用于诊断高原头痛患者的microRNA分子标志物组合物的制作方法

本发明属于分子生物技术及生物医疗领域，涉及用于诊断高原头痛患者的microrna分子标志物组合和试剂盒。

背景技术：

1、高原头痛(high-altitude headache，hah)，又称高原性头痛或高海拔性头痛，根据国际头痛病学会(international headache society，ihs)定义，该病发生在长期生活于低海拔地区的平原人，在未适应新环境的情况下快速进入海拔2500m以上的高原后24小时内，表现为双侧额颞部轻度至中度的钝痛或压迫痛。地理学上把海拔高于500m，地势相对平坦或者有一定起伏的广阔地区叫高原，医学上将海拔高于2500m的地方叫高原。hah发病率较高，根据进入高原速度和海拔高度的不同，发病率高达25％至90％(luks，a.m.andp.h.hackett，medical conditions and high-altitude travel.《the new englandjournal of medicine》，2022.386(4):p.364-373)；该病危害性很大，轻者会严重影响急进高原人群的日常生活质量和降低其工作劳动能力，更严重的是，如果hah没有得到有效的控制与治疗，可进展成为具有高致死率的高原肺水肿(high-altitude pulmonary edema，hape)和高原脑水肿(high-altitude cerebraledema，hace)(pham k.，k.parikh ande.c.heinrich，hypoxia and inflammation：insights from high-altitude physiology.《frontiers in physiology》，2021.12:p.676782)。

2、hah有明显的遗传倾向性及个体易感性，高原低氧的环境因素和遗传因素均可以影响hah的发生。多年以来，hah的遗传倾向性及个体易感性一直是国内外学者关注的热点，尽管已有人已经提出使用低氧相关基因epas1、ppara、vegfa及nrf2等基因单核苷酸位点对hah易感人群进行筛选，但是目前看来这些标记物在准确性和特异性等方面都不尽如人意(yu j.et al.，analysis of high-altitude syndrome and the underlying genepolymorphisms associated with acute mountain sickness after a rapid ascent tohigh-altitude.《scientific reports》，2016.6:p.38323；shen,y.et al.，associationof epas1 and ppara gene polymorphisms with high-altitude headache in chinesehan population.《biomed research international》，2020.2020：p.1593068；guo y.etal.，can acute high-altitude sickness be predicted in advance？《reviews onenvironmental health》，2022)。而我国高原面积辽阔(约占国土面积的1/5)，且平均海拔高(青藏高原平均海拔在4000m以上)。近年以来，随着我国高原地区旅游业及经济建设的蓬勃发展，现在每年都有超过2000万人从平原进入高原从事旅游、商贸和建设，而hah的高发不仅给他们的生活和工作造成十分严重的影响，而且亦给高原地区的较脆弱卫生机构造成沉重的负担。所以亟待寻找到在平原对hah的发病易感性进行预测的有效方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于诊断筛查高原头痛患者的microrna分子标志物组合物，还提供其应用和试剂盒。本发明所要解决的技术问题是，找到一种或几种平原唾液microrna标志物可以诊断出hah患者。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1.提供一种用于诊断高原头痛患者的microrna分子标志物组合，microrna为hsa-mir-222-3p和hsa-mir-23-3p。

4、2.还提供一种应用，microrna分子标志物表达水平的检测试剂在制备诊断高原头痛患者试剂盒中的应用，microrna分子标志物为hsa-mir-222-3p和hsa-mir-23-3p。

5、进一步，所述hsa-mir-222-3p的序列如seq id no.4所示，所述hsa-mir-23-3p的序列如seq id no.3所示。

6、进一步所述的应用中，检测样本为血浆或唾液。

7、进一步，所述检测试剂通过rt-pcr、实时荧光定量聚合酶链式反应、northernblotting、原位杂交、微阵列技术、芯片、高通量测序平台检测样本中所述microrna分子标志物的表达水平。

8、进一步所述的应用中，所述检测试剂为rt引物，hsa-mir-222-3p的rt引物序列如seq id no.8所示，所述hsa-mir-23-3p的rt引物序列如seq id no.7所示。

9、3.还提供一种高原头痛的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括检测样本中microrna分子的表达水平的检测试剂，所述microrna为hsa-mir-222-3p和hsa-mir-23-3p。

10、进一步，所述诊断试剂盒包含能够与microrna分子结合进行rt反应的rt引物。

11、进一步，所述诊断试剂盒还包括5x reverse transcription buffer，rtase mix和rnase-free h2o。

12、进一步，所述诊断试剂盒包含能够分别与microrna分子rt产物特异性结合并进行qpcr扩增的引物。

13、优选的，所述诊断试剂盒还包括microrna rt反应体系，所述microrna rt反应体系按每10μl计，包括：茎环rt引物1μl，5x reverse transcription buffer 2μl，rtase mix2μl，rnase-free h2o 3μl，其余2μl为测试rna。

14、进一步，所述诊断试剂盒中，还包括microrna qpcr反应体系，所述microrna qpcr反应体系按每20μl计包括：sybr green mix 10μl，microrna qpcr正向引物0.8μl，microrna qpcr反向引物0.8μl，ddh2o 6.4μl，其余为rt反应产物2μl。

15、本发明的有益效果在于：本发明提供用于诊断高原头痛患者的hsa-mir-222-3p和hsa-mir-23-3p microrna分子标志物组合，以及包含检测该microrna分子标志物的试剂盒，通过在hah患者和健康人的验证队伍中进行验证，发现以所述标志物组合对噬血细胞性淋巴组织细胞增生症诊断的灵敏度为94.59％，特异性为77.14％，二者联合对辅助诊断高原头痛病症具有重要意义。