本发明属于药物分离纯化，具体涉及一种自甘草酸单铵盐母液膏中分离甘草酸单铵盐和甘草苷的方法。
背景技术：
1、甘草作为一种历史悠久的中药材，具有多种治疗功效，包括促进血液循环、清理体内毒素、缓解咳嗽和痰多、止血、以及滋补脾胃等。甘草的主要活性成分之一甘草酸在多个行业中有广泛的应用，尤其是在医药、食品加工和烟草制品中。甘草酸的衍生产品包括甘草酸单铵盐、钾盐、钠盐和锌盐以及甘草次酸等。甘草酸单铵盐在食品行业常作为增甜剂使用，在烟草制品中作为口味改良剂，在化妆品制造业中被用作活性成分。对于这些用途，甘草酸单铵盐的纯度标准可以相对宽松。然而，当甘草酸单铵盐用于医药领域时，由于它们具有抗癌、降低毒性和增强药效的功能，因此对纯度的要求更为严格，通常需要高纯度以便用于制药片剂或注射剂等。
2、甘草的活性成分甘草黄酮类化合物，主要包括甘草苷、甘草素、异甘草素和光甘草定以及甘草多糖。在这些成分中，甘草苷作为黄酮类化合物的一个关键单体，展现出强大的药理作用。研究证明，甘草苷不仅具有显著的抗抑郁效果，还对神经细胞的损伤具有保护性作用，并对心脏和肝脏的毒性提供防护。此外，甘草苷也展现出抗病毒和抗炎的多重活性。甘草酸本身则具有抗炎和抗病毒的属性，同时，它还具有抗菌、抗癌和抗过敏的功能，甘草酸也被用作生产甘草甜味素的原料，这种甜味素在食品行业中得到了广泛的应用。然而，甘草酸和甘草苷在结构中的相似性使其不易分离。
3、中国专利cn 114634534 b公开了一种从甘草酸单铵盐母液中分离甘草酸单铵盐及甘草苷的方法，此发明提供的方法能够更好的将生产甘草酸单铵盐后的母液膏中的甘草酸单铵盐进行回收，从而提高了甘草酸单铵盐的利用率，减少了资源浪费；且通过合理控制大孔径树脂的种类以及洗脱过程中洗脱剂的种类以及梯度洗脱步骤，进一步提高了甘草苷的分离效率，使甘草苷的收率和纯度都明显提高。然而，对于分离出的甘草酸单铵盐的纯度却较低，且分离出的甘草苷中仍然含有少量甘草酸。
4、因此，亟需开发一种新型的分离纯化方法，使其能够分离出高纯度的甘草酸单铵盐和甘草苷。
技术实现思路
1、针对现有的技术问题，本发明的目的在于提供一种自甘草酸单铵盐母液膏中分离甘草酸单铵盐和甘草苷的方法。本发明提供的方法使用双相萃取技术先初步分离出甘草酸单铵盐相和甘草苷相，有助于后续更好地分离提纯，进而提高了甘草酸单铵盐的利用率，减少了资源浪费；同时，采用柱层析法分离纯化得到了甘草苷，并通过有机溶剂二次提纯，提升了甘草苷的分离效果，使甘草苷的收率和纯度也得以提高，具有较好的应用价值。
2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
3、本发明提供了一种自甘草酸单铵盐母液膏中分离甘草酸单铵盐和甘草苷的方法，包含如下步骤：
4、s1.将无机盐溶解于去离子水中，得到无机盐溶液，备用；将甘草酸单铵盐母液膏、有机溶剂1混合，加热至65-85℃，搅拌直至溶解，得到甘草酸单铵盐溶液，备用；
5、s2.将步骤s1中得到的无机盐溶液、甘草酸单铵盐溶液混合，离心分离，分别收集上相溶液和下相溶液；
6、s3.将步骤s2得到的下相溶液倒入透析袋，在去离子水中浸泡透析30-40h，置于2-6℃冰箱保存，每10-12h换一次去离子水，得到甘草酸单铵盐粗品；
7、s4.将步骤s3得到的甘草酸单铵盐粗品、有机溶剂2混合，加热至65-85℃，搅拌直至溶解，冷却至室温，再加入有机溶剂3，搅拌，静置24-48h，抽滤，将得到的固体干燥后得到甘草酸单铵盐；
8、s5.将步骤s2得到的上相溶液进行复合树脂柱和聚酰胺柱的吸附洗脱，烘干，得到甘草苷粗品；
9、s6.将步骤s5得到的甘草苷粗品用混合溶液萃取3-4次，合并下层的溶液，再加入有机溶剂4，萃取3-4次，收集上层的溶液，浓缩，60-70℃烘干，得到甘草苷。
10、本技术使用无机盐和有机溶剂双相萃取技术先初步分离出甘草酸单铵盐相和甘草苷相，甘草苷分布在有机溶剂相，甘草酸单铵盐分布在盐水相，有助于后续更好地分离出纯度较高的甘草酸单铵盐和甘草苷。
11、在一些实施方式中，步骤s1中所述无机盐为碳酸钾、磷酸钾、磷酸氢钾、磷酸氢钠和磷酸二氢钾中的任意一种或多种；且所述无机盐水溶液的质量分数为25-45％。
12、优选地，步骤s1中所述无机盐为磷酸氢钾和/或磷酸二氢钾，且所述无机盐水溶液的质量分数为30-35％。
13、在一些实施方式中，步骤s1中所述有机溶剂1为20-40wt％的无水乙醇溶液，且甘草酸单铵盐母液膏和有机溶剂1的质量比为1：(50-500)。
14、优选地，步骤s1中所述有机溶剂1为30-35wt％的无水乙醇溶液，且甘草酸单铵盐母液膏和有机溶剂1的质量比为1：(250-450)。
15、申请人通过选择特定的无机盐和有机溶剂无水乙醇并限定两者的质量分数，来实现甘草酸单铵盐相和甘草苷相的初步分离。一方面，当无机盐的质量分数一定时，加入乙醇的量增多，有助于争夺水分子，乙醇相体积变大，甘草苷易溶于乙醇，增大乙醇质量分数，有助于甘草苷在上相富集；然而若乙醇浓度增大会导致对水分子的竞争能力增强，进而下相水溶性的甘草酸单铵盐和甘草多糖富集过小，适宜的有机溶剂浓度有利于物质的分离。
16、另一方面，当乙醇浓度一定时，增大体系中无机盐浓度，导致水合能力增强，极性增大，上相体积减小，下相体积增大，萃取率较佳，且质量分数为25-45％时避免了无机盐可能出现的盐析现象，进而使得甘草酸单铵盐和甘草多糖的萃取率减小。
17、更为重要地是，申请人调控甘草酸单铵盐母液膏和有机溶剂1的质量比来提高两相的萃取率。甘草酸单铵盐母液膏过量会使下相萃取液因饱和而不能完全溶解，进而导致萃取率减小；然而，甘草酸单铵盐母液膏中的甘草酸和甘草苷主要分配在乙醇相，两者共同竞争乙醇水溶液，因而分配系数的变化不同于下相萃取液，可见需要结合两相的特性选择合适的甘草酸单铵盐母液膏和有机溶剂1的质量比。
18、在一些实施方式中，步骤s2中所述离心分离的转速为3000-4000r/min，离心分离的时间为10-25min。
19、离心分离的时间不会影响上相与下相的占比稳定性，然而离心分离的时间会影响分配系数，且主要影响甘草酸单铵盐和甘草多糖的分配系数。离心时间不当，会使得下相富集不完全或富集饱和，尤其是富集饱和后还可能会有少量甘草多糖向上相转移，影响萃取率。进一步地，申请人选择离心分离的转速为3000-4000r/min，并将离心分离时间控制在10-25min，可保证双相萃取率。
20、在一些实施方式中，步骤s3中所述透析袋的截留分子量为1000。
21、本技术的双相萃取技术虽能很好地分离甘草酸单铵盐相和甘草苷相，然而在下相溶液中不仅含有需要分离的甘草酸单铵盐，还含有甘草酸单铵盐母液膏中的另一主要杂质甘草多糖。申请人选用透析法分离甘草多糖和甘草酸单铵盐，利用透析袋的截留分子量特性，选择特定截留分子量为1000的透析袋，使分子量小于1000的甘草酸单铵盐及无机盐透析到袋外，而分子量大于1000的甘草多糖保留在袋内，提高了甘草酸单铵盐的分离纯度。
22、申请人控制透析温度为2-6℃，低温可以减少大分子物质甘草多糖的凝胶效应，使得透析过程更加顺畅；同时，在低温条件下，大分子物质甘草多糖的扩散速率减慢，而小分子物质无机盐和甘草酸单铵盐的扩散速率相对较快，有助于提高分离纯度。
23、在一些实施方式中，步骤s4中所述的有机溶剂2为50-80wt％的无水乙醇溶液，有机溶剂3为冰乙酸；且所述甘草酸单铵盐粗品、有机溶剂2和有机溶剂3的质量比为(0.14-0.2)：1：(17-20)。
24、甘草酸单铵盐粗品中还含有无机盐杂质，与有机溶剂2混合并加热，控制有机溶剂2的浓度，使得甘草酸单铵盐粗品充分溶解于有机溶剂中，接着在冷却后的溶液加入冰乙酸，降低溶液的ph值，进而使甘草酸单铵盐的溶解度降低，最终以沉淀的形式从溶液中析出，从而得到纯化度高的甘草酸单铵盐固体。
25、进一步地，申请人调控甘草酸单铵盐粗品、有机溶剂2和有机溶剂3的质量比，使得甘草酸单铵盐更好地从混合物中分离。
26、在一些实施方式中，步骤s5中所述的复合树脂柱采用的复合树脂为体积比1：(4-5)的d201树脂和hp600树脂的组合物或d101树脂和hp20树脂的组合物。
27、在一些实施方式中，步骤s5中所述吸附洗脱的具体步骤如下：
28、将步骤s2得到的上相溶液上样，上样量与复合树脂柱采用的复合树脂的体积比为1：(3-7)，用柱床体积2.5bv的去离子水洗脱，将得到的洗脱液1上聚酰胺柱，洗脱液1和聚酰胺柱的体积比为1：(5-10)，用柱床体积1bv的体积比为1：(3-4)的去离子水和0.5-1wt％的稀乙醇洗脱，再用柱床体积1.5bv的体积比为1：(0.5-1)的去离子水和0.5-1％wt的稀乙醇洗脱，将得到的洗脱液2烘干，得甘草苷粗品。
29、本发明采用一种创新的方法，在上相溶液中分离纯化甘草苷时通过合理控制复合树脂、洗脱剂的种类和比值，以及吸附洗脱的步骤，明显提高了甘草苷的分离效率，使甘草苷的收率和纯度都明显提高，也为二次纯化创造了条件。
30、在一些实施方式中，步骤s6中所述混合溶液由水和乙酸乙酯组成。
31、优选地，步骤s6中所述混合溶液由水和乙酸乙酯的体积比为1：1。
32、在一些实施方式中，步骤s6中所述有机溶剂4为正丁醇，且下层的溶液与有机溶剂4的体积比为1：(1-1.5)。
33、甘草酸和甘草苷在水和乙醇等溶剂中的溶解度不同，通过使用混合溶剂水和乙醇对甘草苷粗品进行萃取，可以基于“相似相溶”原理，将甘草苷从其他不溶或难溶成分中分离出来。通过调整水和乙醇的比例，可以进一步优化甘草苷的溶解和萃取效率。更进一步地，加入正丁醇进行后续萃取，由于正丁醇的极性介于水和乙醇之间，可以进一步从水乙醇溶液中富集甘草苷，达到二次提纯的目的。
34、此外，本技术得到的甘草苷无需再经过结晶处理，即可达到较高的纯度，避免了进一步的结晶处理造成甘草苷的收率大幅降低。
35、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
36、1.本发明提供的方法使用双相萃取技术先初步分离出甘草酸单铵盐相和甘草苷相，有助于后续更好地分离提纯，进而提高了甘草酸单铵盐的利用率，减少了资源浪费；同时，采用柱层析法分离纯化得到了甘草苷，并通过有机溶剂二次提纯，提升了甘草苷的分离效果，使甘草苷的收率和纯度也得以提高，具有较好的应用价值。
37、2.本发明通过选择特定的无机盐和有机溶剂无水乙醇并限定两者的质量分数，并调控甘草酸单铵盐母液膏和有机溶剂无水乙醇的质量比来提高两相的萃取率，为后续进一步分离奠定了基础，进而申请人调控离心分离的转速与分离时间，保证双相萃取率。
38、3.本发明通过透析法分离得到的甘草酸单铵盐和甘草多糖，通过冰乙酸进一步分离出无机盐，得到纯度更高的甘草酸单铵盐。
39、4.本发明分离纯化甘草苷时通过合理控制复合树脂、洗脱剂的种类和比值，以及吸附洗脱的步骤，明显提高了甘草苷的分离效率，进一步通过调整水和乙醇的比例并加入正丁醇进行后续提纯，能够富集高纯度甘草苷。
40、5.本发明得到的甘草苷无需再经过结晶处理，即可达到较高的纯度，避免了进一步的结晶处理造成甘草苷的收率大幅降低。与之相比，本技术的方法在确保产量的同时，有效提升了甘草苷的纯度。