SERS光纤探头及微液滴高通量筛选系统和制备、检测、筛选方法

本发明涉及生物工程，特别是涉及一种sers光纤探头及微液滴高通量筛选系统和制备、检测、筛选方法。

背景技术：

1、工业菌种是绿色生物制造的“芯片”，高性能工业菌种的开发离不开高效、自动化的菌种选育技术与装备。传统的筛选方法大多采用摇瓶或是平板进行，结合测序、pcr或特定响应机制来进行菌株筛选，整个体系耗时长、仪器复杂、试剂用量多且筛选效率低下。

2、在过去几年中，随着筛选需求的多样化，微液滴的高通量筛选显示出了巨大的前景，其核心是将单个菌株封装在微流控液滴中，每个液滴相当于一个微型反应器，对单个特定菌株进行分析，独立无交叉污染。目前，以荧光为检测信号是最常用的微液滴高通量筛选策略，但对于无法被荧光标记的细胞中代谢物含量的测定具有关键的局限性。对于无法荧光标记的野生型菌株和工程菌株，虽然目前也有一些通过拉曼光谱来筛选菌株的案例，但仅限于较低通量的筛选，最高4.5个/秒。而且，目前已有的拉曼显微技术用于样品分析时存在缺陷，以微生物单细胞测量为例：单细胞拉曼光谱信号强度较弱，尤其是当细胞悬浮于液体中时，通常仅有106-8分之一的光子通过拉曼散射，导致获得完整可信的拉曼光谱信号的光谱扫描时间较长，在针对大量的样品分析时，每个细胞进行全谱识别，会大幅度增加样品的分析时间，从而致使采集通量较低，尚无法完全满足实际需求。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种sers光纤探头及微液滴高通量筛选系统和制备、检测、筛选方法，以实现基于sers的高速、精确、无损的微液滴分选，在微液滴分选时，能够满足以下至少一个要求：

2、a)对菌株类型要求低的；

3、b)对检测和筛选的灵敏度要求高的；

4、c)对筛选的通量和准确度要求高的；

5、d)对经分选后的液滴中的内容物，如单细胞，不造成生理性损伤的。

6、为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

7、本发明第一方面，提供一种sers光纤探头，包括锥形光纤探头，所述锥形光纤探头的一端连接锥状结构，所述锥状结构的表面沉积一层金属纳米颗粒作为sers基底。

8、作为优选，所述金属纳米颗粒为金纳米颗粒、银纳米颗粒或金纳米颗粒和银纳米颗粒的复合物。

9、本发明第二方面，提供一种如上所述的sers光纤探头的制备方法，包括：

10、通过氢氟酸腐蚀锥形光纤探头，以在锥形光纤探头的一端形成锥状结构，

11、在所述锥状结构的表面沉积一层金属纳米颗粒作为sers基底。

12、本发明第三方面，提供一种基于如上所述的sers光纤探头的检测方法，包括：

13、对比目标化合物的拉曼谱图和模拟微液滴的标准溶液sers谱图，确定符合检测信号的拉曼特征峰；

14、将不同浓度的目标化合物标准溶液制作成微液滴，利用各浓度微液滴的拉曼谱图的拉曼特征峰相对拉曼强度与浓度作线性关系，确定特征峰强度与目标化合物浓度的对应关系，所述特征峰强度为拉曼谱图的拉曼特征峰相对拉曼强度。

15、本发明第四方面，提供一种微液滴高通量筛选系统，包括：

16、液滴生成模块，用于将菌液中的单个细胞包裹成第一微液滴；

17、液滴孵育模块，用于第一微液滴的孵育和发酵，得到第二微液滴；

18、sers液滴分选模块，用于目标菌株的高通量筛选；所述sers液滴分选模块包括微液滴分选芯片、拉曼系统和如上所述的sers光纤探头，所述微液滴分选芯片上设置有液流通道、第一油相通道、第二油相通道、分选通道、目标通道以及废弃通道，所述液流通道用于接入所述第二微液滴，所述第一油相通道和第二油相通道均用于接入油相，所述分选通道的两端分别为第一端部和第二端部，所述液流通道、第一油相通道、第二油相通道均设置于所述第一端部，以将所述第二微液滴和油相通入所述分选通道，所述目标通道和废弃通道均设置于所述第二端部，所述sers光纤探头设置于所述分选通道，用于对所述分选通道内的第二微液滴进行监测，以得到sers谱图，所述拉曼系统对应所述分选通道位置布设，用于获取所述分选通道内第二微液滴的拉曼谱图，对应所述第二端部设置有分选动力单元，所述分选动力单元用于控制所述分选通道的第二微液滴的流向。

19、作为优选，所述sers液滴分选模块还包括控制模块，所述拉曼系统和sers光纤探头的信号输出端连接所述控制模块的信号输入端，所述控制模块的信号输出端连接所述分选动力单元的信号输入端，所述控制模块用于：

20、对比所述所述拉曼系统和sers光纤探头馈送的sers谱图和拉曼谱图，以确定拉曼特征峰；

21、基于如上所述的检测方法所确定的特征峰强度与目标化合物浓度的对应关系，确定所述分选通道内第二微液滴的浓度；

22、基于设定的浓度阈值，在第二微液滴的浓度大于等于所述浓度阈值的情况下，通过所述分选动力单元控制第二微液滴流向目标通道，在第二微液滴的浓度小于所述浓度阈值的情况下，通过所述分选动力单元控制第二微液滴流向废弃通道。

23、作为优选，所述液滴生成模块包括液滴制备芯片，所述液滴制备芯片上设置内相流道、第一外相流道、第二外相流道以及混流流道，所述内相流道、第一外相流道、第二外相流道均设置于所述混流通道的一端，所述混流通道的另一端连接所述液滴孵育模块；其中，所述内相流道用于向所述混流通道通入菌液，所述第一外相流道和第二外相流道用于向所述混流通道通入油相。

24、作为优选，还包括目标液滴收集单元和废弃液滴收集单元，所述目标液滴收集单元用于收集所述目标通道流出的液滴，所述废弃液滴收集单元用于收集所述废弃通道流出的液滴。

25、本发明第五方面，提供一种微液滴高通量筛选方法，基于如上所述的微液滴高通量筛选系统，所述方法包括：

26、建立微生物突变体库；

27、将微生物突变体库中的菌液输入至液滴生成模块制备成多个第一微液滴；

28、将多个第一微液滴在液滴孵育模块中静置孵育发酵以得到第二微液滴；

29、将第二微液滴再注入sers液滴分选模块进行微流控分选。

30、作为优选，所述液滴生成模块中所用油相为包含2.0％-5％pico-surf表面活性剂的hfe-7500氟化流体。

31、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

32、1.本发明通过微液滴包封在先，孵育在后的方式，保证在培养发酵过程中各菌株相互独立，互不影响。

33、2.本发明实现了基于sers的微液滴高通量筛选，通量可达180个/秒，较现有其他基于拉曼光谱的单细胞分选技术提高两个数量级以上。

34、3.本发明在提高通量的同时依然保证了分选精度(＞98％)。

35、4.本发明筛选系统及方法采用液滴微流控系统，大大减少了对细胞的损伤，便于分选后的下游处理。

36、总之，本发明提供了一套基于sers的微液滴高通量筛选系统以及相应的分选方法，解决了原先难以进行高通量分选的问题，具有简单可行、适用范围广、可扩展性强等优点。