一种巨噬细胞焦亡的研究以及抑制方法

本发明涉及化学细胞研究领域，尤其涉及一种巨噬细胞焦亡的研究以及抑制方法。

背景技术：

1、脓毒症是指宿主对感染的免疫应答失调而引起的危及生命的器官功 能障碍。患者常表现为发热、心源性休克、呼吸和/或全身器官功能衰竭。脓毒 症是一个重要的健康问题，也是全球发生危重疾病和死亡的主要原因。仅 2017年，全球就有大约 4890 万新发脓毒症病例，其中与脓毒症相关的死亡人数为 1100 万例，这占全世界死亡总数的 19.7%。

2、尽管近年来医疗技术水平不断提高，脓 毒症依然是造成重症监护室病人死亡的主要原因，长期死亡率为 40%-80%。急 性肺损伤作为脓毒症最常见的并发症，其病理特点是肺泡-毛细血管膜损 伤，中性粒细胞聚集活化，产生大量的炎症和细胞毒性介质，血管通透性增加， 渗出蛋白液，炎症细胞从肺血管向间质和肺泡间隙迁移。人类 ali/ards 发病时的急性病理生理变化包括严重低氧血症，以及肺顺应性降低导致的总胸廓顺应 性下降，而肺水肿的显著增加是由于内皮和上皮细胞的通透性增加，与肺泡上皮 积极清除肺泡液的能力受损有关，这些变化导致严重的通气/灌注不匹配和分流率增加。

3、细胞焦亡是区别于细胞凋亡的新型程序性细胞 死亡，主要由 gasdermin（gsdm）家族蛋白诱导并释放成熟白细胞介素 1-β （interleukin1-β, il-1β）和白细胞介素 18（interleukin18, il-18）产生炎性级联反应。巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2～3周，多用做原代培养，难以长期生存。

4、目前对于巨噬细胞焦亡的研究并不是很顺利，难以发现其焦亡的过程与何种信息有关。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种巨噬细胞焦亡的研究以及抑制方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种巨噬细胞焦亡的研究以及抑制方法，所述抑制方法包括：atp合酶抑制因子1的研究，线粒体atpif1蛋白的酵解以及atpif1在ali小鼠心肌组织和lps诱导的巨噬细胞中的表达；

3、线粒体atpif1蛋白的酵解过程为我们揭示了其能量调控的潜在机制；在酵解过程中，atpif1通过其特定的结构域与atp合酶相互作用，影响atp的合成和分解，进而调控细胞的能量状态；

4、在ali小鼠的心肌组织中，atpif1的表达量明显升高；这可能是由于心肌细胞在应对缺氧、炎症等刺激时，需要更多的能量来维持其正常功能；而atpif1通过调控atp合酶的活性，影响atp的合成和分解，从而满足心肌细胞对能量的需求；

5、在lps诱导的巨噬细胞中，atpif1的表达量则呈现下降趋势；lps作为一种细菌内毒素，能够激活巨噬细胞并诱导其产生一系列炎症反应；在这个过程中，巨噬细胞需要大量的能量来支持其免疫反应；然而，atpif1的表达降低可能导致atp合酶的活性下降，从而影响atp的合成和分解，使巨噬细胞在能量供应上受到限制。

6、作为上述技术方案的进一步描述：

7、巨噬细胞的焦亡：内毒素可通过经典途径激活 toll 样受体 4（toll-likereceptors 4，tlr4）激活 nlrp3 炎症小体，促进半胱氨酸蛋白酶 1（caspase 1）剪切活化并进一步剪切 gasdermind（gsdmd）形成活性 gsdmd-n 末端及剪切 pro-il-1β 和 pro-il-18 促进其成熟，在细胞膜上形成膜孔释放成熟 il-1β和 il-18 诱发炎性级联反应，促进肺泡巨噬细胞焦亡，最终加重 ali/ards，而抑制 nlrp3 炎症小体的激活则可以阻断巨噬细胞焦亡减轻 ali/ards。

8、具体的、内毒素，作为一种强烈的炎症刺激因子，通过其独特的信号传导机制，在肺部炎症疾病中发挥着关键作用。一旦内毒素通过经典途径激活了toll样受体4（tlr4），一系列复杂的细胞反应便随之触发。其中，nlrp3炎症小体的激活是这一系列反应中的关键环节。

9、nlrp3炎症小体是一个多蛋白复合物，其激活需要多种信号的共同作用。在内毒素的刺激下，nlrp3炎症小体被激活，进而促进了半胱氨酸蛋白酶1（caspase 1）的剪切活化。这一活化的caspase 1进而剪切gasdermind（gsdmd），使其形成具有生物活性的gsdmd-n末端。

10、与此同时，活化的caspase 1还剪切了pro-il-1β和pro-il-18，使其转化为成熟的il-1β和il-18。这两种成熟的炎症因子随后在细胞膜上形成的膜孔中释放，从而触发了广泛的炎性级联反应。这种级联反应不仅加剧了肺部的炎症反应，还促进了肺泡巨噬细胞的焦亡。

11、肺泡巨噬细胞的焦亡是ali/ards疾病进程中的重要事件。这些细胞在受到强烈刺激时，会经历一种程序性细胞死亡，即焦亡。焦亡的巨噬细胞会释放大量的炎症介质和细胞碎片，进一步加剧了肺部的损伤和炎症反应。

12、因此，抑制nlrp3炎症小体的激活成为了阻断巨噬细胞焦亡、减轻ali/ards的有效策略。通过药物或其他手段抑制nlrp3的激活，可以阻断其下游的炎症反应链，从而减轻肺部的损伤和炎症反应。这为ali/ards的治疗提供了新的思路和方法。

13、作为上述技术方案的进一步描述：

14、atp合酶抑制因子1具有重要的免疫调控功能，其敲除可减轻 lps 诱导的巨噬细胞焦亡和ali。

15、进一步的研究发现，atp合酶抑制因子1的敲除不仅影响巨噬细胞的焦亡过程，还可能对免疫细胞的增殖、分化和凋亡等过程产生深远影响。在敲除atp合酶抑制因子1的个体中，免疫细胞对于一些病原体的应答可能会发生改变，这可能有助于我们更深入地理解免疫系统的工作机制。

16、同时，atp合酶抑制因子1也可能与其他免疫分子存在相互作用，共同调控免疫应答。这些相互作用可能涉及到信号通路的激活或抑制，以及免疫细胞之间的通讯等。因此，对atp合酶抑制因子1的深入研究，有望揭示更多关于免疫调控的新机制和新靶点。

17、作为上述技术方案的进一步描述：

18、线粒体 atpif1 蛋白可能通过介导糖酵解加重巨噬细胞焦亡及 ali。

19、进一步的研究表明，线粒体atpif1蛋白在巨噬细胞焦亡和急性肺损伤（ali）的过程中起到了关键的调控作用。这一蛋白通过介导糖酵解过程，可能加剧了巨噬细胞在炎症环境下的损伤反应。

20、巨噬细胞作为免疫系统的关键组成部分，在抵御病原体和调节炎症反应方面发挥着至关重要的作用。然而，在炎症过程中，巨噬细胞可能遭受过度激活，导致细胞焦亡，进而引发组织损伤。线粒体atpif1蛋白的参与，使得这一过程变得更为复杂。

21、线粒体atpif1蛋白通过介导糖酵解过程，可能加剧了巨噬细胞在炎症环境下的焦亡反应，进而促进了ali的发生和发展。这一发现为我们深入理解巨噬细胞焦亡和ali的机制提供了新的视角，也为未来开发针对这些疾病的治疗策略提供了新的思路。

22、作为上述技术方案的进一步描述：

23、线粒体atp合成酶抑制因子 1（atp synthase inhibitory factor 1, atpif1）是由核编码的 12kda 蛋白质分子，在所有组织中均广泛表达，尤其是能量需求高的组织和器官，主要通过与线粒体f0f1-atp合成酶（或称为线粒体呼吸链复合体v）相互作用调控atp的合成和水解，从而调节细胞代谢等生物学功能；

24、线粒体f0f1-at合成酶是由线粒体基质中的可溶性催化 f1 区和膜包埋的 f0 区组成。

25、作为上述技术方案的进一步描述：

26、atpif1在lps诱导的小鼠肺组织及巨噬细胞中显著增加，atpif1 的特异性敲除可减轻 lps 诱导的ali；并且在lps诱导的ali中与炎症相关的基因大量富集，尤其是与巨噬细胞焦亡相关的炎症基因，atpif1flox小鼠在 lps 刺激后 il-1β、il-18和nlrp3显著增加，而atpif1特异性敲除后 il-1β、il-18和nlrp3明显减少。

27、作为上述技术方案的进一步描述：

28、smad4 可作用于糖酵解酶pkm2和线粒体atpif1，增加足细胞中糖酵解和减少氧化磷酸化atpif1可抑制f0f1-atp合成酶活性，阻断线粒体呼吸电子传递链中电子流动，促使线粒体 ros 产生并稳定hif-1α，最终激活糖酵解，而atpif1特异性敲除后可阻断该代谢重编程。

29、作为上述技术方案的进一步描述：

30、抑制方法的步骤包括：

31、atpif1 在 ali 小鼠心肌组织和 lps 诱导的巨噬细胞中的表达；

32、s1、建立ali模型：在lps 诱导的ali模型中，随lps刺激时间的逐渐增加，atpif1的蛋白和mrna 表达出现先升高后降低的趋势，且均高于基线水平；（与0 h 相比，*p＜0.05）；

33、s2、atpif1在lps诱导的thp-1巨噬细胞中的蛋白与mrna表达情况。免疫印迹western blot和rt-pcr结果显示：lps刺激巨噬细胞后，atpif1蛋白表达在lps刺激后的第6h开始出 现升高，atpif1 mrna表达则在lps 刺激后持续升高；（与0 h相比，*p＜0.05）；

34、s3、atpif1在lps诱导的beas-2b上皮细胞和huvec内皮细胞中的蛋白表达情况；免疫印迹western blot和rt-pcr结果显示：lps刺激beas-2b上皮细胞和huvec内皮细胞后，atpif1蛋白表达基本不变，无显著性差异；

35、s4、生物信息学技术分析与atpif1基因启动子区域相结合的转录因子。生物信息学技术分析结果显示在atpif1基因启动子区域共检测到46个调控转录因子，经筛选后atf6和klf4两个转录因子与atpif1转录强相关；

36、s5、atf6和klf4对atpif1的转录调控作用；免疫印迹western blot结果显示：用atf6的sirna抑制其功能后，pbs组和lps组atpif1的表达均被显著抑制；而用klf4的sirna抑制其功能后，lps组atpif1的表达较pbs组显著增加；提示转录因子atf6可参与调控atpif1的转录，而klf4不可以。

37、作为上述技术方案的进一步描述：

38、抑制方法的步骤包括：

39、atpif1敲除改善小鼠脓毒症肺损伤；

40、s1、验证atpif1特异性基因敲除小鼠的敲除效果。免疫印迹western blot结果显示：atpif1mko小鼠atpif1蛋白无表达，说明atpif1基因敲除小鼠模型构建成功；

41、s2、lps注射12h后，各组小鼠肺损伤、肺部炎症水平的比较；h&e染色结果显示atpif1敲除可明显抑制ali小鼠肺组织中炎症细胞浸润，减轻ali。相关试剂盒检测结果显示atpif1敲除可抑制肺组织中mpo的活性、减少肺泡灌洗液中总细胞数和总蛋白量；（与control+atpif1 flox，*p＜0.05；与lps+atpif1 flox，#p＜0.05）；

42、s3、lps注射后各组小鼠的生存曲线。atpif1敲除可显著延长ali小鼠的生存时间；（与lps+ atpif1 flox，#p＜0.05）。

43、作为上述技术方案的进一步描述：

44、抑制方法的步骤包括：

45、atpif1敲除减轻脓毒血症小鼠巨噬细胞焦亡；

46、s1、与atpif1相关性强的基因主要为炎症相关基因，尤其是与细胞焦亡相关的基因；

47、s2、c lps 注射12 h 后，各组小鼠肺泡灌洗液中细胞因子的表达。elisa分析结果显示：atrpif1敲除可明显抑制ali小鼠肺泡灌洗液中细胞因子il-1β和il-18的升高；（与control+atpif1 flox，*p＜0.05；与lps+atpif1 flox，#p＜0.05）；

48、s3、glps 注射12 h 后，各组小鼠肺组织巨噬细胞焦亡标志物蛋白表达。免疫印迹western blot 结果显示：atrpif1敲除可明显抑制ali小鼠肺组织中nlrp3、il-1β和il-18的升高，表明atrpif1敲除具有抑制ali小鼠肺巨噬细胞焦亡的效应；（与control+atpif1flox，*p＜0.05；与lps+atpif1 flox，#p＜0.05）。

49、本发明具有如下有益效果：

50、本发明进一步提供了atpif1在脓毒症肺损伤中的具体作用机制。

51、在深入研究过程中，我们发现atpif1在脓毒症肺损伤中起到了关键作用。脓毒症肺损伤发生时，lps的刺激导致atpif1的表达增加，进而促进了il-1β、il-18和nlrp3等炎症因子的显著上升。然而，当atpif1被特异性敲除后，这些炎症因子的表达明显减少，表明atpif1在调控脓毒症肺损伤中的炎症反应起到了重要作用。

52、进一步的研究揭示了atpif1的作用机制。atpif1通过抑制f0f1-atp合成酶的活性，阻断线粒体呼吸电子传递链中的电子流动。这一过程导致线粒体ros的产生增加，进而稳定了hif-1α，并激活了糖酵解过程。这种代谢重编程是脓毒症肺损伤中的一个重要环节，而atpif1的敲除能够阻断这一过程，从而减轻肺损伤。

53、此外，我们还发现atpif1在ali小鼠心肌组织和lps诱导的巨噬细胞中的表达存在特定的变化模式。在ali模型中，随着lps刺激时间的增加，atpif1的表达呈现出先升高后降低的趋势。而在lps诱导的巨噬细胞中，atpif1的蛋白和mrna表达也呈现出明显的变化。这些发现为我们进一步理解atpif1在脓毒症肺损伤中的作用提供了重要线索。

54、综上所述，本发明揭示了atpif1在脓毒症肺损伤中的关键作用及其作用机制，为脓毒症肺损伤的治疗提供了新的思路和方法。通过特异性敲除atpif1，我们可以有效地抑制脓毒症肺损伤中的炎症反应和代谢重编程过程，从而减轻肺损伤并提高患者的生存率。这一发现为未来的药物研发提供了新的靶点，有望为脓毒症肺损伤的治疗带来突破性的进展。