用于识别和表征T细胞受体和T细胞抗原的工程化的多组件系统的制作方法

发明领域本发明涉及多组件系统的构建、组装和使用，所述多组件系统包含至少三种组件，所述组件是工程化的抗原呈递细胞(eapc)，工程化的基因组接收位点和匹配的遗传供体载体。本发明用于快速、高通量地产生呈递多种形式的抗原分子的稳定的衍生细胞，用于识别和表征这些抗原和同源tcr序列。本发明的介绍t淋巴细胞(t细胞)的免疫监视是所有下颚脊椎动物适应性免疫的核心功能。通过t细胞亚型间丰富功能多样性实现t细胞的免疫监视，其用于消除病原体感染和肿瘤细胞并协调对入侵病原体、共生微生物、共生非自身因子如食品的分子成分的适应性免疫应答，甚至保持自身的免疫耐受性。为了应答各种外来和自身因子，t细胞必须能够特异性地检测这些外来和自身因子的分子成分。因此，t细胞必须能够检测个体遇到的大面积的自身和非自身分子，具有足够的特异性以引起对抗致病性器官和患病自身的有效反应，同时避免引起这种针对健康自身的反应。当考虑到外来和自身分子几乎无限的多样性时，这项任务的高度复杂本性变得清晰，并且病原生物正处于逃避t细胞检测的进化压力下。t细胞受体(tcr)t细胞主要由t细胞受体(tcr)的表达来定义。tcr是t细胞的组成部分，其负责与t细胞适应性免疫的靶标相互作用并且感测它。一般而言，tcr由呈递在细胞表面上的异二聚体蛋白质复合体组成。两条tcr链中的每一条由两个细胞外结构域组成，即可变(v)-区和恒定(c)-区，两者都是免疫球蛋白超家族(igsf)结构域，形成反平行β-片层。它们通过i型跨膜结构域锚定在细胞膜中，所述i型跨膜结构域邻接短的细胞质尾部。适应和检测不同分子成分的t细胞的质量来自t细胞发生过程中产生的tcr链的变异。这种变异是通过体细胞重组以与b细胞中抗体发生相似的方式产生的。tcr链多样性t细胞池由几个功能和表型异质的亚群组成。然而，根据它们在其表面表达的体细胞重排的tcr形式，t细胞可广义地分类为αβ或γδ。存在两种tcr链对形式；tcrα(tra)和tcrβ(trb)对；以及trcγ(trg)和tcrδ(trd)对。表达tra:trb对的t细胞称为αβt细胞，而表达trg:trd对的t细胞通常称为γδt细胞。αβ和γδ形式的tcr负责不同的配体或'抗原'的识别，并且每个t细胞在t细胞成熟期间从头产生αβ或γδ受体链。这些从头产生的tcr链对通过在称为体细胞v(d)j重组的过程中通过产生受体序列多样性来实现识别的多样性，其中每个t细胞表达单个明显重排的tcr的拷贝。在tra和trg基因座处，许多离散的可变(v)和功能性(j)基因区段可用于重组并与恒定的(c)基因区段并置，因此称为vj重组。在trb和trd基因座的重组另外包括多样性(d)基因区段，并且被称为vdj重组。每个重组tcr拥有唯一配体特异性的潜力，其通过在αβt细胞的情况下由α和β链形成的配体结合位点的结构或在γδt细胞的情况下由γ和δ链形成的配体结合位点的结构决定。tcr的结构多样性主要局限于每条链上的三个短发夹环，称为互补决定区(cdr)。从受体链对的每条链贡献三个cdr，并且这六个cdr环共同位于tcr细胞外结构域的膜-远端以形成抗原结合位点。每种tcr链中的序列多样性以两种模式实现。首先，用于重组的基因区段的随机选择提供了碱基序列多样性。例如，trb重组发生在47个唯一的v，2个唯一的d和13个唯一的j种系基因区段之间。通常，v基因区段贡献cdr1和cdr2环两者，因此是种系编码的。产生序列多样性的第二种模式发生在高变cdr3环内，其通过在重组v，(d)和j基因区段之间的连接处随机缺失模板核苷酸和添加非模板核苷酸而产生。tcr:cd3复合体成熟的αβ和γδtcr链对呈递在具有许多辅助cd3亚基(表示为ε、γ、δ和ζ)的复合体的细胞表面。这些亚基与αβ或γδtcr结合为三个二聚体(εγ、εδ、ζζ)。该tcr:cd3复合体形成了在αβ或γδtcr与同源抗原接合时启动细胞信号传导反应的单元。缔合为tcr:cd3复合体的cd3辅助物贡献了被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的信号基序。cd3ε、cd3γ和cd3δ各自贡献单个itam，而cd3ζ同二聚体含有3个itam。因此，与tcr组装的三个cd3二聚体(εγ、εδ、ζζ)贡献10个itam。在tcr与同源抗原连接后，串联酪氨酸残基的磷酸化为含有src同源性2(sh2)结构域的蛋白质(例如70kda的关键ζ链相关蛋白(zap-70))产生成对的停靠位点。这些蛋白质的再次募集启动tcr:cd3信号传导复合体的形成，其最终负责t细胞活化和分化。αβt细胞αβt细胞通常在人类中比其γδt细胞对应物更丰富。大多数αβt细胞与细胞表面上由hla复合体呈递的肽抗原相互作用。这些肽-hla(phla)识别t细胞是第一个被描述的并且是迄今为止被最佳表征的。还描述了更罕见形式的αβt细胞。粘膜相关的不变t(mait)细胞似乎具有相对有限的α和β链多样性，并且识别细菌代谢物而不是蛋白质片段。不变的自然杀伤t细胞(inkt细胞)和种系编码的分枝酰基反应性t细胞(gemt细胞)限于识别由非hla分子交叉呈递的糖脂。inkt细胞主要被认为与cd1d呈递的糖脂相互作用，而gemt细胞与cd1b呈递的糖脂相互作用。认为其他形式的t细胞在cd1a和cd1c的背景下与糖脂相互作用，然而，这些细胞尚未以显著的细节表征。常规αβt细胞大多数αβt细胞的关键特征是在hla分子的背景下识别肽抗原。这些通常被称为“常规”αβt细胞。在个体内，自身hla分子将自身和外来蛋白质的肽呈递给t细胞，为针对恶性肿瘤和外来病原体的适应性免疫，对共生生物、食品和自身的适应性耐受提供必要的基础。编码hla蛋白的hla基因座是人类基因组中最基因密集和多态的区域，并且在人类中描述了超过12,000个等位基因。hla基因座中的高度多态性确保了个体之间肽抗原呈递的多样性，这对于群水平的免疫是重要的。hlai类和ii类有两种形式的经典hla复合体：hla i类(hlai)和hla ii类(hlaii)。有三种经典的hlai基因：hla-a，hla-b，hla-c。这些基因编码跨膜α链，其与不变的β2-微球蛋白(β2m)链缔合。hlaiα链由具有免疫球蛋白折叠的三个结构域组成：α1，α2和α3。α3结构域是近膜的并且大部分是不变的，而α1和α2结构域一起形成多态性膜-远端抗原结合裂隙。有六种经典的hlaii基因：hla-dpa1、hla-dpb1、hla-dqa1、hla-dqb1、hla-dra和hla-drb1。这些基因编码包含α链和β链的配对dp、dq和dr异二聚体hla复合体。每条链具有两个具有免疫球蛋白折叠的主要结构结构域，其中α2和β2结构域包含与hlaiα3结构域类似的近膜和大部分不变的模块。hlaiiα2和β2结构域一起形成膜远端抗原结合裂隙并且是高多态性的区域。hlai和hlaii的抗原结合裂隙在八个反平行β-片层的平台上包含两个反平行的α-螺旋。在该裂隙中，肽抗原结合并以延伸的构象存在。hlai和hlaii中的肽接触残基是大多数序列多态性的位置，其构成由不同hla等位基因呈递的多种肽库的分子基础。该肽与抗原结合裂隙广泛接触并且结果是每个hla等位基因对所呈递的肽施加不同的序列限制和偏好。因此，给定的肽仅结合有限数量的hla，并且相应地每个等位基因仅适应来自给定蛋白质的肽集合的特定部分。存在于每个个体中的一组hlai和hlaii等位基因称为hla单倍型。hlai和hlaii基因的多态性以及遗传等位基因的共显性表达驱动了人群中hla单倍型的非常大的多样性，当与αβtcr的巨大序列多样性相偶联时，呈递出对这些hla抗原-tcr相互作用的分析的标准化的高度障碍。hlai和hlaii的αβtcr接合αβtcr识别肽作为由hla和肽抗原(改变的自身)的残基形成的混合phla结合界面的一部分。hlai复合体呈递在几乎所有有核细胞的表面上，并且通常被认为是呈递源自内源蛋白质的肽。因此，t细胞可以通过对相互作用细胞的phlai复合体进行取样来询问hlai呈递细胞的内源性细胞蛋白质组。hlai的接合需要通过相互作用的t细胞表达tcr共受体cd8，因此hlai采样限于cd8+αβt细胞。相反，hlaii复合体的表面呈递主要限于专职apc，并且通常被认为呈递源自呈递细胞外源的蛋白质的肽。因此，相互作用的t细胞可以询问呈递细胞所在的细胞外微环境的蛋白质组。hlaii的接合需要通过相互作用的t细胞表达tcr共受体cd4，因此hlaii采样限于cd4+αβt细胞。αβtcr的胸腺选择如上所述的αβtcr的作用是检测phla复合体，使得tcr呈递t细胞可以提高与该t细胞在建立免疫中的角色密切相关的反应。应该认为，在个体内产生的αβtcr库必须考虑在特定单倍型背景下和实际发生之前可能遇到的所有外来抗原的巨大和不可预见的多样性。该结果是在这样的背景上实现的，其中以准随机方式产生极其多样化和众多的αβtcr，具有识别未指定的phla复合体的潜力，同时仅被特别指示以避免与自身phla的强烈相互作用。这是在称为胸腺选择的过程中在t细胞成熟期间精心策划的。在胸腺中t细胞成熟的第一步期间，携带不能与具有足够亲和力的自身phla复合体相互作用的αβtcr的t细胞被剥夺了存活信号并被消除。称为阳性选择的该步骤确保存活的t细胞携带tcr库，其至少潜在地能够识别在正确的hla背景下呈递的外源或改变的肽。随后，通过阴性选择过程主动去除与自身phla强烈相互作用并因此具有驱动自身免疫能力的潜力的αβtcr。这种阳性和阴性选择的组合仅导致携带αβtcr的t细胞对自身phla的亲和力低，从而填充外周。这建立了αβt细胞库，其是自限制的但不是自身反应性的。这种针对hla单倍型的t细胞发生的高度个性化的性质强调了标准化分析αβtcr-抗原-hla相互作用中的挑战。此外，它形成了移植物排斥和移植物抗宿主疾病的基础，以及在一个个体中识别的αβtcr在第二个体中可能具有完全不同的作用的一般原则，这对临床实践中出现的基于tcr和t细胞的治疗和诊断策略具有明显的影响。非常规αβt细胞非hla限制性或“非常规”形式的αβt细胞具有非常不同的分子抗原靶标。这些非常规αβt细胞不接合经典hla复合体，而是接合保守的hla样蛋白，例如cd1家族或mr1。cd1家族包括参与抗原交叉呈递的四种形式(cd1a，b，c和d)。这些细胞表面复合体具有类似hlai的α-链，其与β2-m形成异二聚体。在α链的膜远端表面处呈递的小疏水口袋形成病原体衍生的基于脂质的抗原的结合位点。先天样nk t细胞(ink t细胞)形成了最佳理解的脂质/cd1家族识别的例子，而gem t细胞代表另一个突出的例子。已知在cd1d的背景下'i型'ink t细胞与脂质α-galcer强烈相互作用。这些ink t细胞显示非常有限的tcr多样性，具有固定的tcrα链(vα10/jα18)和有限数量的β链(具有受限的vβ使用)，并且它们被比作与先天病原体相关的分子模式(pamps)识别受体，如toll样和nod样受体。相反，'ii型'nk t细胞呈递更多样化的tcr库，并且似乎具有更多样化的cd1d-脂质复合体接合模式。gem t细胞识别由cd1b呈递的分枝杆菌衍生的糖脂，然而，cd1a，b和c的抗原呈递的分子细节以及它们的t细胞识别才刚刚开始被理解。mait细胞主要表达不变的tcrα链(trav1-2与traj33，traj20或traj12连接)，其能够与一系列tcrβ链配对。而不是肽或脂质mait tcr可以结合由hlai样分子mr1呈递的病原体衍生的基于叶酸和核黄素的代谢物。在mait tcr上观察到的有限但显著的tcr多样性似乎能够在保守的mr1背景下识别多样但相关的代谢物。尚不清楚如何在成熟期间在胸腺中选择非经典的hla限制性αβt细胞tcr。然而，似乎上面概述的阴性和阳性选择的基本过程仍然适用，并且一些证据表明这发生在胸腺内的特化微环境中。γδt细胞与αβtcr发生和phla接合的详细机制理解相比，关于γδt细胞对应物的抗原靶标和背景知之甚少。这部分是由于它们在循环t细胞区室中的相对低的丰度。然而，广泛认为γδt细胞不是严格受hla限制的，并且与抗体不同，它似乎更自由地识别表面抗原。另外，最近已经认识到γδt细胞可以支配上皮组织的驻留t细胞区室，上皮组织是免疫系统与外来抗原的主要相互作用位点。此外，文献中开始出现γδt细胞肿瘤免疫监视和其他形式的失调自我监测的各种机制。先天样和适应性γδt细胞的特异性抗原靶点仍然定义不明确，但pamp的组织分布和快速识别表明当适应性免疫系统仍在成熟时，γδt细胞在对外来抗原的反应早期以及生命早期中起基本作用。γδt细胞的多种功能似乎基于不同的vγvδ基因区段使用，并且可以在两个主要类别中广泛理解，其中具有大部分不变的tcr的γδt细胞在感染期间很早期介导pamp的先天样的识别。除了pamp之外，这些类型的γδt细胞还被认为识别自身分子，包括可以提供细胞应激、感染和潜在肿瘤发展的非常早期特征的磷酸抗原。识别pamp和所谓的危险相关分子模式(damps)以及大量组织限制的先天样γδt细胞强烈表明这些细胞适合快速响应抗原攻击而无需事先激活、归巢和克隆扩张。第二种形式的γδt细胞被认为在性质上更具适应性，具有高度多样化的γδtcr库和直接外周循环和接近淋巴组织的能力。已经描述了这种针对普通人病原体如cmv的抗原特异性γδt细胞，它们似乎形成记忆反应。然而，还观察到γδt细胞在活化后仅显示相对有限的克隆增殖，并且关于tcr多样性的程度和γδt细胞在外周循环或组织中的特异性反应的数据很少。此外，虽然一般认为γδtcr不与phla复合体相互作用，因此在这种背景下不与肽抗原接合，只有少数γδt细胞的抗原靶标已经被表征，并且对潜在的分子框架仅有很差的了解。外周γδt细胞的低频率和研究人组织驻留t细胞的困难限制了对t细胞参与适应性免疫应答是如何重要及多样类型的了解。这一新兴研究领域需要更可靠的技术来捕获和表征稀有γδt细胞，分离其tcr对，并识别其同源抗原。抗原和抗原呈递细胞在t细胞和tcr的背景下，抗原可以定义为可以与tcr接合并导致信号在t细胞内转导的任何分子。最充分表征的t细胞抗原是呈递在hlai和hlaii复合体中的肽，并且其被常规αβt细胞接合。然而，近年来很明显，非常规αβt细胞和γδt细胞能够作为抗原接合大范围的生物分子，包括脂质、脂肽、糖肽、糖脂和一系列代谢物和分解代谢物。此外，已经发现γδt细胞可能能够以类似抗体的方式直接接合完全折叠的蛋白质。因此，在过去二十年中，t细胞抗原在很大程度上局限于hla呈递的肽的观点已经扩展到包括几乎任何生物分子。考虑到这一概念，定义什么可以被认为是抗原呈递细胞(apc)是相关的。如以上部分中所定义，hlai和hlaii具有跨细胞类型的完全不同的表达谱。广泛接受的是，几乎所有有核细胞都在细胞表面上呈递hlai复合体，因此能够呈递用于t细胞取样的肽抗原。相反，hlaii具有受限的表达谱，并且至少在稳态条件下仅在具有抗原呈递中的专家作用的细胞表面上表达，包括树突细胞(dc)，巨噬细胞和b细胞。这些专家细胞类型通常被称为专职apc。出于本文件的目的，术语apc用于描述能够呈递抗原以供αβ或γδt细胞取样的任何有核细胞。此类抗原不限于在特定抗原呈递复合体(如hla和hla样分子)中作为“货物”呈递的那些，而是也可包括能够与携带αβ或γδtcr的细胞接合的任何细胞表面呈递的部分。tcr的治疗用途原代t细胞的过继转移首先在20世纪90年代早期的临床环境中进行试验，首先是离体扩增的t细胞向病毒抗原极化以在免疫受损患者中赋予病毒免疫。在用于治疗恶性肿瘤的试验后不久，使用针对特定癌抗原离体扩增的原代t细胞的类似方法。这些早期方法的一个局限仍然是当今的挑战，即缺乏对t细胞的性质和多样性的理解，与在治疗产品中精细优化其组成的需要相冲突。目前，除了少数使用对病毒抗原具有特异性的原代t细胞的举措之外，制药工业已大量放弃使用离体扩增的原代t细胞。近年来，可靠地将遗传物质引入原代人细胞的能力已经出现了各种实验性遗传修饰的t细胞治疗剂。此类治疗性细胞产物旨在控制t细胞应答的能力并将t细胞特异性重定向至疾病相关抗原靶标，例如恶性细胞唯一表达的抗原。这些在很大程度上依赖于将嵌合抗原受体(car)转移到受体t细胞中，而不是实际的tcr链对。car代表靶向部分(最常见的是靶向恶性细胞的表面表达蛋白的单链抗体元件)，其移植到信号传导受体元件，例如cd3复合体的ζ-链，以产生模拟cd3-tcr功能的合成的嵌合受体。迄今为止，这些所谓的car t细胞(car-t)产品在临床试验中取得了不同的成功，尽管它们的潜力不易转化超过具有固有的唯一分子靶标的肿瘤(如b细胞恶性肿瘤)。或者，将全长tcr链对orf转移到t细胞中是新出现的兴趣。此类tcr工程化的t细胞疗法目前受限于具有挑战性的制造方法，并且像car-t产品一样，缺乏有效的抗原靶标和靶向构建体。迄今为止，这已经集中在使用αβtcr识别hlai在恶性细胞上呈递的肽抗原，并且该方法的基本挑战是需要恶性细胞特异的抗原。已经认为由于tcr-phla相互作用具有相对低的亲和力，因此天然tcr可能对于tcr工程化的t细胞疗法而言不是最佳的。已经设计了几种方法来体外亲和力成熟tcr，其方式与单链抗体亲和力成熟非常相似。这些tcr亲和力成熟方法通常也使用单链形式，其中一条链的v区与另一条链的v区融合以制备单一多肽构建体。然后可以将这种单一多肽用于适应抗体工程化工作流程的噬菌体或酵母展示系统，并通过基于靶标结合的轮次选择。就产生功能性tcr链对而言，在这种单链tcr方法中存在两个固有限制。首先，选择是基于对靶标的结合亲和力。然而，已经充分证明tcr亲和力并不总是与tcr信号转导输出的强度或能力相关。其次，基于亲和力的单链构建体的选择一旦被重构为全长受体，并不总是转化为等同的亲和力。在治疗背景下，亲和力成熟的tcr对存在另外的且关键的限制。也就是说，考虑到它们的序列已被改变，根据定义，所得构建体不再受到胸腺选择，其中从所述库中缺失了对自身抗原强烈反应的tcr。因此，这些修饰的tcr具有自身反应的固有风险，使用现有方法很难在体外排除。出于同样的原因，任何用于治疗应用的选定或工程化的tcr都需要个性化。如果tcr是人工工程化的或天然tcr应用于个体，则必须基于hla单倍型和呈递的每个特定个体的肽库排除交叉反应性以避免潜在的灾难性自身免疫。这是因为胸腺选择是在所有可用的hla分子的背景上进行的，所述hla分子仅对给定的个体具有特异性。这种交叉反应的可能性尚不清楚。然而，tcr库识别与外源相同物种的其他个体的phla复合体的能力是适应性免疫的基本特性，并且支持移植物排斥和移植物抗宿主病。最近使用成熟的tcr链针对癌症特异性黑素瘤相关抗原(mage)的临床试验突出了绕过胸腺选择的潜在问题。当携带成熟tcr的自体t细胞被输注回两名癌症患者时，这些患者迅速发展为致命性心脏病。随后的研究确定mage特异性成熟的tcr与来自心脏蛋白质titin的hlai呈递的肽交叉反应。这有力地表明交叉反应性在tcr的治疗用途中是明显的可能性。利用tcr用于治疗目的的不同途径是以与抗体治疗物质非常相同的方式用作亲和试剂。已经试验了单链tcr分子，用于将缀合的药物物质递送至特异性hla抗原表达细胞群。这种方法通常被认为比car-t或tcr工程化的t细胞治疗剂更安全，因为可以简单地撤回药物的给药。然而，难以预测的交叉反应和脱靶效应的可能性仍然是这种情况下的潜在限制。临床诊断中的tcr库检测在一个相关的方面，出现了将特定tcr序列的丰度检测用于临床诊断目的的兴趣。特别是随着深度测序方法的兴起，有可能在全局范围内捕获个体内完整的tcr多样性，并在特定背景下捕获匹配的αβ对。这可能仅仅是通过检测扩增的t细胞克隆的丰度来诊断特定病症和疾病状态的手段，作为对患者中疾病相关抗原建立的免疫应答的代理读数。然而，这种全局性方法目前仅限于具有确定的临床时间点的非常强的免疫应答，并且在识别通过测序鉴定的任何特定tcr的特异性抗原靶标方面存在潜在的困难。t细胞抗原的治疗和诊断用途控制适应性免疫应答的基本优势转化为核心技术挑战，因为tcr-抗原相互作用的精确特异性需要对与每种病原体，癌细胞或自身免疫疾病特异性相关的抗原的详细知识。此外，每种抗原可以由特异性抗原呈递复合体或其等位基因呈递，使得对每种相关hla基因和等位基因进行抗原发现。对于与强适应性免疫反应相关并且通常显示保守的表位反应等级的几种感染性疾病如hiv，流感和cmv，最重要的表位已经在一些常见hla的背景下进行了作图。类似地，癌症、过敏和自身免疫领域已经看到增加和系统地努力来绘制相关的t细胞抗原。然而，这些是具有挑战性的程序，并且系统地描述与不同临床背景相关的t细胞抗原的努力受到缺乏有效、稳健、快速和可扩展的方案的阻碍。具体地，癌细胞代表了具有挑战性和重要的方面，因为呈递在恶性细胞表面上的大多数肽是自身抗原或非常类似于自身抗原。因此，胸腺选择将缺失可以强烈识别这些肽的tcr，同时肿瘤已经进化以逃避免疫识别。这意味着针对已建立的肿瘤的有效免疫应答相对较少，并且难以预测或发现靶标。然而，这些反应确实存在，而且重要的是，通常与更好的结果相关。这种反应的靶标，肿瘤相关抗原(taa)，在大多数情况下将具有与自身区分的特征，并且来自在癌症发展期间过度表达的蛋白质，否则在该发育阶段不存在于细胞类型或通过基因突变或翻译后修饰(如磷酸化)进行特异性改变。当可获得时，对这些表位的知识使得有可能询问相关的t细胞反应以用于基本发现、诊断目的，并且例如作为疫苗功效的测试。重要的是，它们还为过敏和自身免疫中的t细胞耐受提供高度特异性的靶标，并且至关重要的是，指向特异性免疫疗法和针对恶性细胞的有价值靶标。恶性肿瘤代表了特别有价值的靶标，因为细胞免疫疗法的前景和t细胞操作的进展因缺乏经验证的靶标taa而减慢，这些taa超出了癌症类型的特异标记恰好可用的少数病例。鉴于细胞疗法的潜力和缺乏有效靶标，有希望的tcr抗原的识别仍然是基于tcr的免疫疗法的最紧迫的瓶颈之一，特别是在治疗癌症的努力中。tcr和t细胞抗原分析的技术方面总体而言，基于tcr的疗法的开发仍处于早期阶段，并且成功有限。虽然具有巨大潜力，但诊断方法很少被用于旨在评估患者疾病状态或对疗法反应的对照临床研究中。用于可靠捕获天然tcr链对的不发达技术，以及在高通量和细胞-细胞通讯的功能背景下对tcr-抗原相互作用的系统分析，已经成为基于tcr的疗法和诊断的开发的主要障碍。深度测序方法已经导致对健康和疾病中t细胞受体多样性的提高的理解。然而，这些方法通常集中于跨越cdr3区域的短延伸，主要是tcrβ链。大多数研究忽略了tcrα链的贡献，并且很少有人试图分析成对的αβ链以及被确定为感兴趣的tcr的抗原特异性。最近使用单细胞包封和遗传条形码的工作流程使得天然tcrαβ或γδ链对的配对和全长序列的分析成为可能，然而，这样的工作流程仍然是实验性的。可以在生物物理或功能模式中根据抗原特异性分析分离的tcr链对。生物物理分析需要重组产生tcr以及可溶形式的分析物抗原。在hla限制性tcr的情况下，这将需要产生所有单独的tcr以及同源的phla复合体。这在技术上具有高度挑战性，速度慢且通量极低。此外，这种分析仅提供相互作用亲和力，其与可预测方式的功能特征不充分相关。直到最近，在细胞背景下的分离的tcr序列的详细功能分析仅限于将分析物tcr链对转染到原代t细胞或永生t细胞系中，以及通过细胞活化的传统流式细胞术分析来检测细胞反应，或在抗原攻击后从转染细胞中检测分泌因子的繁琐方案。在guo等人最近的出版物中，报道了来自单细胞的成对tcr链的快速克隆、表达和功能表征(molecular therapy-methods and clinical development(2016)3：15054)。在该研究中，分析物人αβtcr对在缺乏αβtcr表达的报告细胞系中表达，并且其含有与tcr刺激后激活的nur77启动子连接的绿色荧光蛋白(gfp)报告系统。由于缺乏标准化的tcr整合到报道细胞系基因组中，该系统仍然是低效的，并且没有提供apc元件对细胞结合的抗原攻击的系统方式。与用于识别针对已知t细胞抗原的tcr的工作流程类似，在健康和疾病中新的t细胞抗原的从头发现仍然是非常具有挑战性的。大多数方法本质上保持生物物理学，并且旨在产生可以在免疫方案中测试的候选抗原，或通过识别如上所述的同源tcr。在t细胞抗原发现领域存在很少标准化或没有标准化，并且该领域主要限于学术研究。随着对tcr及其同源物在治疗和诊断用途中的不断增加的兴趣，以及捕获大量天然tcrαβ和γδ链对的手段的出现，仍然缺乏可靠的高通量和标准化技术用于tcr-抗原相互作用的系统分析。重要的是，在细胞-细胞通讯的天然背景下缺乏用于tcr链对的功能分析的标准化系统，其中tcr和抗原都由活细胞呈递。此外，缺乏系统的手段来提供大的候选抗原库来分析带有tcr的细胞或试剂。t细胞抗原的治疗用途随着t细胞生物学知识的迅速发展，人们越来越关注在治疗制剂中使用t细胞抗原。主要是这采取某种类型免疫策略的形式。最突出的是，使用新一代测序方法可以在肿瘤细胞中鉴定大量如此诱变的序列。此类序列可以代表对于癌细胞特有的潜在t细胞抗原，因此可代表针对测序肿瘤的个性化治疗性疫苗的免疫原。然而，由于可观察到大量的基因突变，因此不存在高通量方式来分析这些潜在的t细胞抗原被患者hla库呈递的能力，以及这些抗原是否是免疫原性的。目前，突变肽结合的预测是通过非常少量的hla等位基因计算得到的。这些预测模型松散地告知给定的肽序列是否将与hla结合，并且通常不预测结合抗原的潜在免疫原性。此外，这些计算模型对于抗原不可靠，所述抗原相对于正在分析它们的hla等位基因不存在规范的“锚定”残基。其他免疫方法需要对t细胞抗原的详细知识，例如，包括过敏和自身免疫综合征的耐受性疗法，以及对病原体的预防性疫苗接种。在后一种预防性疫苗的情况下，除少数hla等位基因外，对来自常见病原体的t细胞抗原的知识仍然少得令人惊讶。需要系统的方法来扩展这种知识，以开发针对常见病原体和新发病原体的有效疫苗。

背景技术：

技术实现思路

0、概述

1、在组合的eapc:t系统中，测量一个或多个分析物eapc或一个或多个分析物tc或eapc的标记中的信号响应，对于选择初级系统输出是至关重要的(图27步骤v)，所述信号响应可以通过分析物抗原与分析物tcr之间的复合体的形成来介导(图27步骤iv)，其中初级系统输出是单细胞或细胞池，和/或单个亲和试剂或亲和试剂库和/或单个ncbp或ncbp池。其中细胞或试剂的选择可以在接触的分析物eapc或分析物tc细胞中的任一个和/或两者中的报告的信号响应的存在或不存在时进行，或者通过用亲和试剂或ncbp测量eapc的可测量标记来进行

2、从eapc:t系统获得初级系统输出

3、本发明涉及提供工程化的多组件系统。组件a和一种或多种组件c'和/或一种或多种组件e'用于制备一种或多种分析物eapc群。然后通过eapc:t系统将这些分析物eapc与一种或多种分析物tcr组合以获得一种或多种输出。分析物tcr作为可溶性或固定化试剂提供，呈递在细胞表面上或由非基于细胞的颗粒(ncbp)呈递。分析物tcr的细胞呈递可以是以下任何形式

4、i.原发性t细胞

5、ii.重组t细胞

6、iii.工程化的tcr呈递细胞

7、iv.呈递对分析物抗原具有亲和力的分子的工程化的细胞

8、其统称为分析物tc。

9、该系统由一种或多种分析物eapc群和更多分析物tcr的集合组成(图27)。使用如上所述的多组件系统制备分析物eapc群(图3至16)。eapc:t系统以允许分析物eapc和分析物tcr之间的物理接触的形式提供，其中这种接触允许分析物eapc呈递的一种或多种分析物抗原和分析物tcr之间的复合体形成，其中分析物抗原是以下任何一种

10、i.aapx和/或

11、ii.aam和/或

12、iii.aapx:aam和/或

13、iv.cm和/或

14、v.aapx:cm

15、并且其中分析物tcr被提供为由分析物tc呈递，或由可溶性或固定化分析物亲和试剂呈递，或由分析物ncbp呈递，用于与由分析物eapc呈递的分析物抗原的潜在接合，使得复合体形成可以导致这种复合体的稳定化并且其中可以报导并测量导致eapc的标记和/或分析物eapc和/或分析物tc内的信号传导的诱导。

16、以上描述了报告和/或标记eapc的诱导信号响应的模式，并且恰好是这些报告的响应和/或标记是在获得编辑为eapc:t系统的多组件系统的初级输出时需要测量的。

17、来自eapc:t系统的初级输出是选择的细胞群和/或选择的亲和试剂或选择的ncbp，其中选择是基于以下做出；

18、i.通过亲和试剂或ncbp的可测量的标记eapc和/或

19、ii.在eapc中检测到的信号响应和/或

20、iii.在eapc中缺乏检测到的信号响应和/或

21、iv.在分析物tc中检测到的信号响应和/或

22、v.在分析物tc中缺乏检测到的信号响应；

23、其中初级输出可以表示为单个细胞，或细胞池和/或一个或多个eapc相关亲和力试剂或ncbp。

24、可以基于接触细胞中的响应来选择来自组合的eapc:t系统的分析物亲和试剂、ncbp或分析物tc和/或分析物eapc。也就是说，可以基于接触的分析物eapc中报告的响应或其缺乏来选择分析物tc。相反，可以在接触分析物tcr中的报告的响应或缺乏它的情况下选择分析物eapc，或者在分析物tc是分析物亲和试剂或ncbp的情况下,分析物亲和试剂或ncbp可以从eapc响应中选择分。

25、来自系统的初级eapc和/或分析物tc输出是所选择的细胞，其中基于分析物tc或eapc中的报告的信号响应的存在或不存在进行选择，并且这些细胞可以包含eapc中的一种或多种和/或一种或多种分析物tc，其中所选择的细胞可以包含单个细胞，相同身份的细胞池，不同身份的细胞池(图27步骤v)。

26、来自系统的初级分析物亲和试剂或ncbp输出是具有或不具有相关亲和试剂或ncbp的选择的细胞，其中基于分析物eapc的标记或报告的信号响应的存在或不存在进行选择，其中选择的亲和试剂或ncbp可包含单一亲和试剂或ncbp，相同身份的亲和试剂或ncbp池，不同身份的亲和试剂或ncbp池(图27步骤v)。

27、二元组合物的输出

28、在组合的eapc:t系统中分析物eapc和/或分析物tc中报告的信号可用于选择分析物细胞群以提供初级输出。

29、在本文背景中，通过从二元系统中选择用分析物tcr标记的所需分析物eapc群，分析物eapc的初级输出可以在这样的情况下实现，其中组合的eapc:t系统是一种或多种分析物eapc与分析物tcr的二元组合物(例如图24)。

30、通过从二元系统中选择用分析物亲和试剂或分析物ncbp标记的所需分析物eapc群，分析物亲和试剂或分析物ncbp的初级输出可以在这样的情况下实现，其中组合的eapc:t系统是一种或多种分析物eapc与分析物亲和试剂或分析物ncbp的二元组合物(例如图24)。

31、通过从组合的培养系统中选择所需的分析物apc和/或分析物tc群，eapc和/或分析物tc类型的初级输出可以在这样的情况下实现，其中组合的eapc:t系统具有固定分析物eapc和汇集的库分析tc性质(例如图22)，或在这样的情况下实现，其中组合的eapc:t系统是固定分析物tc和分析物eapc的汇集库(例如图23)性质。

32、通过从组合培养系统中选择所需的分析物eapc群，分析物eapc的初级输出可以在这样的情况下实现，其中组合的eapc:t系统具有固定分析物tcr和汇集的分析物eapc库性质(例如图24)，或者在这样的情况下实现，其中组合的eapc:t系统是固定eapc和可溶性分析物亲和试剂的汇集库或ncbp性质。

33、通过从组合培养系统中选择所需的分析物亲和试剂或分析物ncbp群，分析物亲和试剂或分析物ncbp的初级输出可以在这样的情况下实现，其中组合的eapc:t系统是固定的可溶性分析物亲和试剂或分析物ncbp和汇集的分析物eapc库性质(例如图24)或在这样的情况下实现，其中组合的eapc:t系统是固定的eapc和汇集的分析物亲和试剂库或分析物ncbp性质。

34、获得输出的模式

35、有几种不同的模式可以用以获得初级输出，其中每种模式都需要细胞分选步骤。可以通过荧光激活细胞分选(facs)和/或磁激活细胞分选(macs)和/或不同的亲和激活细胞分选方法来实现分选。

36、初级输出eapc和/或分析物tc细胞，和/或eapc相关亲和试剂或ncbp可以通过单细胞分选获得，以获得单个细胞和/或通过对池的细胞分选以获得细胞池。

37、初级输出eapc和/或分析物tc细胞可以通过单细胞分选获得，以获得单个细胞，并且任选地随后长出单个细胞以获得所选择的eapc或分析物tc细胞的单克隆池。

38、初级输出eapc和/或分析物tc细胞也可以通过对池的细胞分选获得细胞池，并且任选地随后长出细胞库以获得所选择的eapc和/或tc细胞池。

39、从eapc:t系统获得终端系统输出

40、在上述获得初级输出的方法之后，其中选择初级输出分析物eapc和/或分析物tc和/或分析物ncbp，其基于测量的信号响应或稳定的复合体形成而选择，使得来自eapc:t系统的终端输出可以通过进一步处理所选择的eapc和/或分析物tc和/或ncbp初级输出来获得(图27，步骤vi)。

41、来自多组件系统的终端输出是以下的身份

42、i.aapx和/或

43、ii.aam和/或

44、iii.aapx:aam和/或

45、iv.cm和/或

46、v.aapx:cm和/或

47、vi.tcr

48、由分析物apc或分析物tc或分析物亲和试剂或分析物ncbp呈递，并通过从组合的eapc:t系统中选择而获得作为多组件系统的初级输出。

49、在eapc:t系统内，通常情况是由分析物eapc和分析物tc呈递的分析物分子是遗传编码的。还可能的情形是分析物ncbp具有遗传编码的身份，例如，在ncbp是噬菌体的情况下。因此，为了识别由分析物eapc或分析物tc或分析物ncbp呈递的分析物分子，可以进行所制备的分析物eapc、tc和ncbp的基因测序。

50、可以处理所选择的初级输出，以便获得分选的和/或扩增的细胞的基因组或转录组的基因序列，以确定以下的身份

51、i.aapx和/或

52、ii.aam和/或

53、iii.aapx:aam

54、iv.cm和/或

55、v.aapx:cm和/或

56、vi.分析物tcr

57、其中所获得的身份代表来自eapc:t系统的终端输出。

58、可以处理拥有遗传组件的ncbp，使得获得分选的ncbp的基因组或转录组的遗传序列以确定分析物tcr的身份，其中所获得的身份代表来自eapc:t系统的终端输出。

59、可以处理eapc，使得获得分选的和/或扩增的tc细胞的组件b'和/或组件d'的基因序列，以确定分析物抗原的身份，其中获得的分析物抗原的身份代表来自eapc:t系统的终端输出。

60、可以处理分析物tc，使得获得分选的和/或扩增的tc细胞的基因组或转录组的遗传序列，以确定分析物tcr的身份，其中获得的tcr的身份代表来自eapc:t系统的终端输出。

61、无论是否经过特定处理，遗传测序可以通过一系列模式实现，也可以从排列遗传材料来实现。测序步骤之前可以是

62、i.提取基因组dna和/或

63、ii.提取组件b'和/或d'rna转录物和/或

64、iii.通过pcr和/或rt-pcr扩增组件b'和/或d'的dna和/或rna转录物

65、测序步骤可能对作为来自多组件系统的初级输出所获得的eapc或tc、ncbp或其池具有破坏性。

66、如果希望从eapc:t系统获得初级输出，其中测序步骤对初级输出eapc具有破坏性，则可以使用作为多组件系统的终端输出所获得的序列信息来制备等效输出eapc作为分析物eapc。

67、在上述遗传编码的分析物分子的情景中，eapc:t系统的终端输出可以通过从组件b'和/或d'和/或从细胞基因组和/或转录组获得序列信息来获得。然而，在一些实施方案中，抗原信息不会被遗传编码。经过翻译后修饰的抗原，通过非遗传方式提供给组合的eapc:t系统的抗原，从分析物eapc蛋白质组或代谢物的诱导或修饰状态中出现的抗原，eapc:t系统固有的cm，可能无法通过基因测序手段合理地鉴定。

68、在可以通过非遗传方式提供给eapc:t系统的aam的重要情况中，存在两种不同的模式，apc可以通过这两种模式将提供的aam呈递为aapx:aam复合体。在第一种情景下，aam以可直接结合aapx并在细胞表面形成aapx:aam复合体的形式提供(图18)。这种aam的实例是hla复合体的肽抗原。在第二种情景下，提供的aam的形式可以由分析物eapc接收并处理，使得它作为货物装载在aapx中并在细胞表面形成aapx:aam复合体(图19)。

69、一种选择和识别aam货物或cm货物的方法，其中货物是代谢物和/或肽，其被加载到作为多组件系统的初级输出所选择和获得的eapc的aapx中，所述方法包括

70、i.分离aapx:aam或aapx:cm或货物am或货物cm和

71、ii.识别装载的货物

72、其中所识别的装载货物(cm或aam)代表多组件系统的终端输出。

73、通常存在两种模式，通过这两种模式可以从所选择的apc中识别货物分子。首先，从aapx:aam或aapx:cm强制释放货物导致可用于随后识别的aam或cm的分离(图25)。这方面的一个例子是酸洗eapc以从hla复合体中释放肽aam。其次，aapx:aam或aapx:cm的捕获，例如，通过释放复合体和免疫亲和分离方法，导致aapx:aam或aapx:cm复合体的分离，使得可以识别aam或cm(图26)。

74、直接或从分离的aapx:aam或aapx:cm复合体中识别分离的aam和/或cm的方法可包括i.质谱分析

75、ii.肽测序分析

76、其中包含aam和/或cm身份是来自多组件系统的终端输出。

77、使用eapc:t系统测定分析物tcr对分析物抗原的亲和力

78、在上述获得初级输出的方法之后(其中初级输出是基于测量的信号响应所选择的分析物eapc细胞)，可以对eapc初级输出进行亲和力分析以确定分析物抗原对同源分析物tcr的亲和力，其中分析物抗原是以下任何一种

79、i.aapx和/或

80、ii.aam和/或

81、iii.aapx:aam和/或

82、iv.cm和/或

83、v.aapx:cm

84、并且其中分析物tcr作为可溶性亲和试剂提供或由分析物tc或分析物ncbp呈递，使得分析物抗原的亲和力根据以下方法测定

85、i.使用分析物tcr在浓度范围内标记所选择的分析物eapc

86、ii.对步骤a的染色分析物eapc进行facs分析

87、iii.确定分析物eapc在分析物tcr浓度范围内的荧光标记强度

88、iv.计算分析物抗原对分析物tcr的亲和力

89、在本上下文中，分析物抗原的亲和力也可以通过前述方法确定，但其中也可以包括标记的参照，使得使用分析物抗原荧光强度与参照荧光强度的比率来计算亲和力，其中标记的参照选自

90、i.用分析物抗原之一的亲和试剂标记的分析物eapc

91、ii.呈递标记的参照分析物抗原的细胞或颗粒。