杜鹃花属SSR分子标记、引物组合物及其应用

本发明涉及杜鹃花属分子标记，尤其是涉及杜鹃花属ssr分子标记、引物组合物及其应用。

背景技术：

1、杜鹃花是杜鹃花科(ericaceae)杜鹃花属(rhododendron)植物的统称，常绿或落叶灌木，有较强的鉴赏性，常用作园林内绿化植物。杜鹃花的食用及药用价值较高，且在保水固土、维护生态平衡等方面发挥重要作用，在我国有悠久的种植历史。杜鹃属是杜鹃花科中最大的属，全世界有1200余种，全球杜鹃花品种已经超过3万个，广泛分布于亚洲、北美洲、欧洲，其中90％以上的种集中分布于亚洲东部，中国是野生杜鹃花资源最丰富的国家。杜鹃花多通过杂交育种开发新品种，但由于目前其分类体系不够完善、亲缘关系混乱不清，致使育种工作阻碍重重。

2、简单序列重复(ssr,simple sequence repeat)，亦被称作微卫星(microsatellite)，为基因组中由大约1-6个核苷酸组合而成的基本单位进行多次重复从而构成的一段dna序列。ssr分子标记以其共显性遗传、所需dna用量少、操作简单、数量丰富、种属间具有很强的通用性和多态性、实验重复性好等优点。tpm13-ssr(simple sequencerepeat with tailed primer m13)技术结合了ssr分子标记技术和荧光测序技术，具有重复性高、结果准确等优点，在较大程度上解决了传统凝胶电泳分析通量较低、扩增产物检测流程繁琐、数据记录工作量大等一系列问题。

3、近年来，ssr分子标记在杜鹃花属中的应用研究大幅增加，但由于杜鹃花属基因组序列的挖掘尚不完全，从ncbi数据库中可搜索到杜鹃花属公开发表的基因组数据极为有限，只有10个物种(包括灵宝杜鹃r.henanense、白花杜鹃r.mucronatum、杜鹃r.simsii、朱红大杜鹃r.griersonianum、红马银花r.vialii、羊踯躅r.molle、马银花r.ovatum、欧洲杜鹃r.ferrugineum、r.kiyosumense、圆叶杜鹃r.williamsianum)的基因组数据被公开，占整个杜鹃花属物种数量的0.8％，可供研究使用数据非常贫乏。在该情况下，利用ssr进行研究有其意义，ssr标记能够在一定程度上弥补基因组数据不足的限制，在遗传多样性、基因定位及分子标记辅助育种、遗传图构建等方面具有较高的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供杜鹃花属ssr分子标记、引物组合物及其应用，以在目前杜鹃花属基因组数据有限、基因挖掘尚不完全情况下，为杜鹃花属种质资源鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性研究、基因定位、分子标记辅助育种、遗传图谱构建提供扩增条带清晰、多态性高、重复性好的分子标记。

2、为实现上述目的，本发明提供杜鹃花属ssr分子标记，共30个，其中6个的重复单元为二碱基，24个为三碱基，分别为a-001、a-016、a-018、a-022、a-049、a-052、a-254、a-260、a-264、a-267、a-272、a-290、a-300、a-313、a-321、aa-334、a-335、a-336、a-341、a-345、a-346、a-349、a-350、a-353、a-354、a-356、a-362、a-363、a-368、a-394。

3、优选地，a-001的重复单元为ta，重复次数为8；a-016的重复单元为tc，重复次数为8；a-018的重复单元为ca，重复次数为9；a-022的重复单元为ag，重复次数为9；a-049的重复单元为at，重复次数为8；a-052的重复单元为ct，重复次数为8；a-254的重复单元为ccg，重复次数为5；a-260的重复单元为acc，重复次数为5；a-264的重复单元为ggt，重复次数为5；a-267的重复单元为gga，重复次数为6；a-272的重复单元为aga，重复次数为5；a-290的重复单元为gaa，重复次数为5；a-300的重复单元为cga，重复次数为7；a-313的重复单元为gac，重复次数为5；a-321的重复单元为ctt，重复次数为7；a-334的重复单元为atg，重复次数为5；a-335的重复单元为gct，重复次数为5；a-336的重复单元为tct，重复次数为5；a-341的重复单元为gcg，重复次数为5；a-345的重复单元为cct，重复次数为7；a-346的重复单元为gaa，重复次数为5；a-349的重复单元为gaa，重复次数为5；a-350的重复单元为cct，重复次数为5；a-353的重复单元为cac，重复次数为5；a-354的重复单元为tct，重复次数为5；a-356的重复单元为gcg，重复次数为5；a-362的重复单元为tcc，重复次数为5；a-363的重复单元为ttc，重复次数为5；a-368的重复单元为gtg，重复次数为5；a-394的重复单元为cag，重复次数为5。

4、优选地，a-001的正向引物序列如seq id no.1所示，反向引物的序列如seq idno.2所示；a-016的正向引物序列如seq id no.3所示，反向引物的序列如seq id no.4所示；a-018的正向引物序列如seq id no.5所示，反向引物的序列如seq id no.6所示；a-022的正向引物序列如seq id no.7所示，反向引物的序列如seq id no.8所示；a-049的正向引物序列如seq id no.9所示，反向引物的序列如seq id no.10所示；a-052的正向引物序列如seq id no.11所示，反向引物的序列如seq id no.12所示；a-254的正向引物序列如seqid no.13所示，反向引物的序列如seq id no.14所示；a-260的正向引物序列如seq idno.15所示，反向引物的序列如seq id no.16所示；a-264的正向引物序列如seq id no.17所示，反向引物的序列如seq id no.18所示；a-267的正向引物序列如seq id no.19所示，反向引物的序列如seq id no.20所示；a-272的正向引物序列如seq id no.21所示，反向引物的序列如seq id no.22所示；a-290的正向引物序列如seq id no.23所示，反向引物的序列如seq id no.24所示；a-300的正向引物序列如seq id no.25所示，反向引物的序列如seq id no.26所示；a-313的正向引物序列如seq id no.27所示，反向引物的序列如seq idno.28所示；a-321的正向引物序列如seq id no.29所示，反向引物的序列如seq id no.30所示；aa-334的正向引物序列如seq id no.31所示，反向引物的序列如seq id no.32所示；a-335的正向引物序列如seq id no.33所示，反向引物的序列如seq id no.34所示；a-336的正向引物序列如seq id no.35所示，反向引物的序列如seq id no.36所示；a-341的正向引物序列如seq id no.37所示，反向引物的序列如seq id no.38所示；a-345的正向引物序列如seq id no.39所示，反向引物的序列如seq id no.40所示；a-346的正向引物序列如seq id no.41所示，反向引物的序列如seq id no.42所示；a-349的正向引物序列如seq idno.43所示，反向引物的序列如seq id no.44所示；a-350的正向引物序列如seq id no.45所示，反向引物的序列如seq id no.46所示；a-353的正向引物序列如seq id no.47所示，反向引物的序列如seq id no.48所示；a-354的正向引物序列如seq id no.49所示，反向引物的序列如seq id no.50所示；a-356的正向引物序列如seq id no.51所示，反向引物的序列如seq id no.52所示；a-362的正向引物序列如seq id no.53所示，反向引物的序列如seq id no.54所示；a-363的正向引物序列如seq id no.55所示，反向引物的序列如seq idno.56所示；a-368的正向引物序列如seq id no.57所示，反向引物的序列如seq id no.58所示；a-394的正向引物序列如seq id no.59所示，反向引物的序列如seq id no.60所示。

5、一种杜鹃花属种质鉴定、遗传多样性或亲缘关系分析的产品，所述产品为试剂或试剂盒，所述产品中包含上述ssr分子标记。

6、一种如上所述的产品在杜鹃花属种质鉴定、遗传多样性和亲缘关系分析中的应用。

7、如上所述的杜鹃花属ssr分子标记在杜鹃花属种质鉴定、遗传多样性和亲缘关系分析中的应用。

8、如上所述的杜鹃花属ssr分子标记在杜鹃花属种质鉴定、遗传多样性和亲缘关系分析中的使用方法，正向引物5′端加不带荧光标记的m13接头，反向引物不变，再用一条带有荧光基团的m13引物，总共三条引物对待分析样品进行pcr扩增，将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，进行荧光毛细管电泳检测，根据获得的峰图和参数，将片段数据转化为“0”、“1”矩阵，利用ntsys-pc软件计算ssr位点的dice相似系数并进行非加权组类平均法聚类分析，确定亲缘关系和种质。

9、优选地，m13接头/引物的序列如seq id no.61所示，荧光基团为fam、hex、tamrad和rox中的一种。

10、优选地，所述pcr扩增程序为94℃，3min；94℃，94℃，30s；56℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min。

11、因此，本发明提供的杜鹃花属ssr分子标记、引物组合物及其应用，其具体技术效果如下：

12、(1)本发明提供的ssr及引物组合物，在杜鹃花各品种中扩增条带清晰、多态性高、重复性好，可准确、高效、稳定地鉴定杜鹃花种质资源，操作简便；

13、(2)本发明提供的ssr及引物组合物，能够用于杜鹃花各亚属间种质鉴定、遗传多样性和亲缘关系分析，结果稳定可靠，为杜鹃花属种质资源管理、育种、遗传保护、杜鹃花群体间和群体内的遗传多样性分析等奠定了基础；

14、(3)本发明提供的ssr及引物组合物，能够很好地区分各个野生种，可以用于不同亚属的遗传分析和分类研究。

15、下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。