一种含bPEI-PVA的血液检测保存试剂、制备方法和检测试剂盒与流程

本发明涉及医药检测保存试剂，尤其涉及一种含bpei-pva的血液检测保存试剂、制备方法和检测试剂盒。

背景技术：

1、在现代医学和生物学研究中，血液样本分析正变得越来越重要。血液样本是最常见的样本类型之一，是临床上最容易获得的人体标本，常用来做各种检测和研究。血液在生物体内有着广泛的流动性和最重要的物质传输作用，分子成分主要包含代谢产物、生物激素、抗体、酶 、无机盐等，用以反映生物体最直接、最有效代谢情况是非常合适的。然而，血液样本的复杂性和多样性使得其中核酸的保护和提取面临诸多挑战。

2、譬如，rna在人类的许多的生理和病理过程中都发挥着至关重要的作用。高质量rna可以满足文库构建、rt-pcr、q-pcr、转录组测序、dot blot、芯片分析等。然而，rna本身为单链，极不稳定，且血液中大部分的核酸存在于白细胞中，而白细胞在血细胞中含量最少，并且血液中含有丰富的rna酶，同时许多外源性的因素如外源性的rna酶，保存和提取过程都可能影响rna的实验结果。这就使血液rna保存和提取非常棘手，常常因时间过久而发生降解。因此选择合适的血液检测保存试剂就显得非常重要。

3、影响核酸降解的因素很多，主要分为物理因素，化学因素和生物因素：

4、1.物理因素：温度，机械剪切力、核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等；

5、2.化学因素：ph值，水解反应，氧化反应等；

6、3.生物因素：酶解及微生物侵染等作用。

7、因此，血液检测保存试剂的配制需要重点考虑生物因素和化学因素，科学选择原料及其配备比例，避免核酸降解。而支链聚乙烯亚胺（bpei）是一种有效的核酸保护剂，申请人申请（申请人申请的发明专利，申请号：2024108232852）公开了支链聚乙烯亚胺（bpei）具有良好的核酸结合能力。然而，bpei在某些情况下可能具有一定的细胞毒性。为了降低其毒性并增强其生物相容性，采用聚乙烯醇（pva）修饰bpei是一种有效的策略。pva是一种生物相容性高的高分子材料，通过与bpei结合，可以提高其稳定性和核酸保护效果，同时减少细胞毒性。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，提供一种血液检测保存试剂、制备方法和检测试剂盒，该保存试剂确保了血液样本在保存过程中的完整性和检测结果的准确性。

2、为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

3、一种含bpei-pva的血液检测保存试剂，该保存试剂包括以下组分：

4、bpei-pva：1.0-4.0%

5、壳聚糖：0.1-2.0mg/ml

6、银纳米颗粒：0.01-0.2mg/ml

7、抗氧化剂：0.05-2.0mg/ml

8、防腐剂：0.01-1.0%

9、edta：0.1-2.0mm/l；

10、还包括磷酸缓冲液，上述的百分比为质量百分比，ph值调节至7.3-7.5。

11、作为优选，该保存试剂包括以下组分：

12、bpei-pva：1.0-2.0%

13、壳聚糖：0.5-1.5mg/ml

14、银纳米颗粒：0.05-0.15mg/ml

15、抗氧化剂：0.1-1.0mg/ml

16、防腐剂：0.01-0.03%

17、edta：0.5-1.5mm/l。

18、作为优选，所述防腐剂选用叠氮化钠所述防腐剂选用叠氮化钠；抗氧化剂选用n-乙酰半胱氨酸。

19、作为优选，该保存试剂还包括甘油9-11%。

20、作为优选，bpei-pva采用采用结构式如下的支链聚乙烯亚胺与1000-3000da的聚乙烯醇制备得到；

21、所述支链聚乙烯亚胺的结构式如下：

22、；n为10-100。

23、作为优选，聚乙二醇修饰支链聚乙烯亚胺的制备方法如下：

24、1）溶解100g 支链聚乙烯亚胺在10l pbs中，充分搅拌至完全溶解；溶解100g 聚乙烯醇在10l dmso中，充分搅拌至完全溶解；‘

25、2）向支链聚乙烯亚胺溶液中加入50g edc和50g nhs，搅拌2小时以活化氨基；

26、3）将活化后的支链聚乙烯亚胺溶液与pva溶液混合，于室温搅拌反应12-18小时；

27、4）通过透析袋进行透析，去除未反应的试剂和溶剂，透析过程在4°c下进行，透析溶液为pbs，透析3天，每天更换透析液；

28、5）透析完成后，将溶液冻干，得到bpei-pva共聚物。

29、进一步，本发明还公开了所述的保存试剂的制备方法，该方法包括如下步骤：

30、1）制备抗凝剂溶液：向无菌蒸馏水中加入抗凝剂，使用磁力搅拌器搅拌，直到抗凝剂完全溶解；

31、2）添加核酸稳定剂：向抗凝剂溶液中依次添加bpei-pva、壳聚糖、银纳米颗粒，并确保每种成分完全溶解后再添加下一种成分；

32、3）添加剩余试剂：添加抗氧化剂、防腐剂和其他试剂，使用ph计监测溶液的ph值，并用tris-hcl调节溶液至ph值7.3-7.5；

33、4)过滤和灭菌：使用0.22µm过滤器对溶液进行过滤灭菌得到保存试剂,将保存试剂分装至无菌试剂瓶中，密封避光保存于4℃。

34、根据权利要求1或2所述的保存试剂，其特征在于，所述试剂溶解温度为室温；步骤（1）中磁力搅拌器搅拌速度为600-800rpm。

35、进一步，本发明还公开了一种血液检测试剂盒，该试剂盒包括保存试剂管以及分装在保存试剂管内如上所述的保存试剂。

36、本发明保存试剂配方设计综合考虑了血液样本在保存过程中的多种潜在降解途径，通过抗凝剂、核酸稳定剂、抗氧化剂和防腐剂的协同作用，确保样本在保存过程中的稳定性和完整性。每种成分的具体作用和浓度都是根据其在防止降解、稳定核酸和保护细胞方面的效果精心设计的，确保最终配方能够满足血液检测保存的高标准要求。

37、本发明由于采用了上述的技术方案，具有以下的技术效果：

38、1、本发明采用了peg修饰支链聚乙烯亚胺（pegylated branched pei）作为主要成分，通过其独特的分子结构和化学性质，有效地提高了核酸的稳定性。peg修饰支链pei具有高效的核酸结合能力，可以与dna和rna紧密结合，形成稳定的复合物，防止核酸在样本处理和保存过程中降解。实验结果显示，使用本发明处理的血液样本，其核酸完整性和质量显著优于传统方法。

39、2、本发明中包含的多种保护成分，如抗氧化剂、稳定剂和防腐剂，能够在多个层面上保护核酸，减少降解和损伤。这些成分的组合不仅提高了核酸的稳定性，还优化了提取过程，减少了杂质和抑制物的影响。结果显示，使用本发明处理的样本，其核酸提取效率显著提高，提取的核酸量更多，纯度更高。

40、3、本发明设计的保护试剂能够在常温和低温条件下长期保存血液样本，确保样本中的核酸在保存期间不受降解。配方中的防腐剂（叠氮化钠）有效防止微生物污染，抗氧化剂则防止氧化应激对核酸的损伤。实验结果表明，使用本发明处理的样本在4℃和-20℃条件下分别保存数天和数月后，核酸仍然保持良好的稳定性和完整性。

41、4、本发明的设计考虑到了实际操作的简便性和可行性。在样本采集现场，血液样本可以直接放入含有本保护试剂的容器中，轻轻振荡混匀即可。这种简便快速的处理方法减少了样本暴露在外界环境中的时间，避免了核酸的降解，提高了核酸的保护效果。

42、5、本发明具有良好的兼容性，适用于不同类型的血液样本和各种下游核酸分析方法，如pcr、rt-pcr、测序等。由于peg修饰支链pei和其他保护成分的良好生物相容性，本发明在核酸提取过程中不会引入显著的干扰物质，确保提取的核酸可以直接用于高精度的分子生物学分析。

43、6、本发明中的peg修饰支链pei通过peg的修饰显著降低了pei的毒性，保证了试剂在处理生物样本时的安全性。此外，配方中的其他成分如甘油、壳聚糖等均为生物相容性良好的化合物，进一步确保了试剂的生物安全性。

44、7、多项实验验证了本发明的优越性能。在对比实验中，使用本发明处理的血液样本在核酸提取量、纯度和稳定性方面均显著优于使用传统方法处理的样本。实验表明，本发明处理的样本中提取的核酸能够成功扩增，且扩增产物的质量和数量均达到高水平。此外，长期保存实验显示，本发明处理的样本在长时间保存后仍能获得高质量的核酸，验证了其在长时间保存中的优越性能。

45、综上所述，本发明通过peg修饰支链pei的创新应用和多种保护成分的协同作用，有效解决了血液样本中核酸保护和提取的难题，显著提高了核酸的稳定性、提取效率和保存性能，具备广泛的应用前景和重要的研究价值。