一种绿猴肾细胞Vero-KO-HDAC2及应用的制作方法

本发明属于基因及细胞生物工程，具体涉及一种绿猴肾细胞vero-ko-hdac2及应用。

背景技术：

1、蛋白质的乙酰化是调节基因表达和信号传导的关键，也是维持机体稳态的决定因素之一。蛋白质的乙酰化通过两种相互拮抗作用的酶——组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase，hd ac)与组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase，hat)动态可逆性的调控。目前在哺乳动物中发现了18个hdacs，根据结构特征分为四个型，其中11种享有序列同源性且均为z n2+依赖型hdacs包括ⅰ(hdac1～3和hdac8)、ⅱ(hdac4～7，hdac9和hdac10)和ⅳ(hdac11)型；nad+依赖型hdac为ⅲ型(sirt1～7)。

2、hdac2在细胞增殖、细胞信号传导、癌症发生和进展、炎症和基因表达调控中发挥重要作用。hdac2的表达和活性受到转录、转录后mrna稳定性和翻译后水平调控的影响，其中影响hdac2基因转录水平的因子包括致癌转录因子(β-catenin)、转录因子4(tcf4)、原癌基因(myc)和激活蛋白2(ap2)等。hdac2蛋白可以抑制肿瘤抑制因子p53表达，促进原癌基因myc表达，进而抑制细胞凋亡，促进细胞周期进程；细胞周期进程的加快，通过反馈回路又促进了hdac2的表达。hdac2基因转录后水平影响因素主要为mrna稳定性，它受到rna结合蛋白hur等的影响。hur与hdac2基因mrna3’-非编码区au富集区结合，调控mrna的稳定性、翻译和定位过程。hdac2蛋白翻译后水平受到丝氨酸磷酸化，赖氨酸泛素化，酪氨酸硝化，半胱氨酸亚硝基化和热休克蛋白hsp70等因子的调控。致癌络蛋白激酶2(ck2)修饰hdac2磷酸化可以促进hdac2蛋白的酶活性、加强hdac2与转录抑制因子、转录因子和启动子区域的相互作用；而包含e1酶，e2泛素偶联酶ubch8，以及e3泛素连接酶rlim的级联反应可以催化hdac2蛋白多泛素化和蛋白酶体降解。硝化和氧化应激可以诱发hdac2的ck2依赖性磷酸化、hdac2酪氨酸硝化和hdac2蛋白酶体降解；维生素a衍生物全反式维甲酸(atra)一方面可通过jun激酶(jnk)诱导hdac2磷酸化，使转录因子klf4(hdac2蛋白的靶蛋白)乙酰化并被激活；另一方面，atra也可诱导ubch8(也称为维甲酸诱导基因b)降低hdac2蛋白水平。hdca2的活性和功能还受到一些脂肪酸和生物活性脂质介质等内源性代谢物影响，如丁酸盐靶向i类和iia类hdacs，可特异性催化hdac2蛋白酶体降解；鞘氨醇-1-磷酸选择性结合并抑制hdac1和hdac2。此外，no供体特异性调节hdac2的功能，hdac2半胱氨酸残基s-亚硝基化使hdac2与启动子分离，除了直接修饰hdac2外，翻译后修饰还调节hdac2蛋白的募集，进而影响hdac2蛋白功能的发挥。

3、小反刍兽疫(ppr)是由副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(pprv)感染山羊、绵羊等小反刍动物引起的一种烈性传染病。woah将ppr规定为法定必须报告的动物疫病，我国将其规定为一类传染病。目前，关于hdacs在pprv感染中的功能还不清楚。

4、crispr-cas9技术是构建基因敲除细胞系的常用手段，但是即使在基因功能抑制的基础上，采用crispr-cas9构建基因敲除细胞系仍然存在较多的挑战。本发明申请人在前期工作中发现，pprv可刺激宿主hdac2 rna转录水平，且i类hdacs的抑制剂mgcd0103可明显抑制pprv病毒的复制。但是在构建hdac2基因的敲除细胞系的过程中也存在很多困难，发明人通过对sgrna选择优化，以及方法构建的随机性结果的基础上，筛选获得了一株hdac2基因的敲除，且能显著抑制pprv的复制的单克隆细胞系vero-ko-hdac2。

技术实现思路

1、针对hdac2基因的敲除细胞系构建存在的困难，本发明通过对sgrna选择优化、构建并筛选获得了一株hdac2基因的敲除，且能显著抑制pprv的复制的单克隆细胞系vero-ko-hdac2，为筛选或制备抑制小反刍兽疫病毒增殖的药物以及为研究小反刍兽疫病毒复制机制或抗小反刍兽疫病毒育种提供了新思路，具体包括以下内容：

2、第一方面，本发明提供了一种绿猴肾细胞vero-ko-hdac2，所述绿猴肾细胞vero-ko-hdac2于2024年4月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2024114。

3、第二方面，本发明提供了上述第一方面所述的绿猴肾细胞vero-ko-hdac2在抑制小反刍兽疫病毒增殖中的应用。

4、第三方面，本发明提供了上述第一方面所述的绿猴肾细胞vero-ko-hdac2在筛选或制备抑制小反刍兽疫病毒增殖的药物中的应用。

5、第四方面，本发明提供了上述第一方面所述的绿猴肾细胞vero-ko-hdac2在制备抗小反刍兽疫病毒药物体外筛选模型中的应用。

6、第五方面，本发明提供了上述第一方面所述的绿猴肾细胞vero-ko-hdac2在制备研究小反刍兽疫病毒复制机制的细胞模型中的应用。

7、第六方面，本发明提供了上述第一方面所述的绿猴肾细胞vero-ko-hdac2在制备抗小反刍兽疫病毒育种的细胞模型中的应用。

8、第七方面，本发明提供了一种用于构建上述第一方面所述绿猴肾细胞vero-ko-hdac2的sgrna，所述sgrna包括如seq id no.1所示的上游引物和如seq id no.2所示的下游引物。

9、第八方面，本发明提供了上述第一方面所述的绿猴肾细胞vero-ko-hdac2的构建方法，所述方法包括以下步骤：

10、(1)制备上述第七方面所述的sgrna，在sgrna片段正向序列的5’端加入cacc粘性末端，在反向序列的5’端加入aaac粘性末端，作为sgrna寡聚核苷酸；

11、(2)将步骤(1)制备的sgrna寡聚核苷酸插入到lenticrispr v2表达质粒载体的多克隆位点，得到同时表达cas9蛋白基因和打靶sgrna序列的重组载体；

12、(3)将步骤(2)制备的重组载体转染宿主细胞，嘌呤霉素筛选获得抗嘌呤霉素阳性细胞，通过亚克隆的方法获得单个细胞株，筛选获得绿猴肾细胞vero-ko-hdac2。

13、本发明的有益效果是：本发明首先提供了一种特异性靶向hdac2基因的sgrna，所述sgrna能够特异性靶向hdac2基因，结合crispr-cas9技术可实现宿主细胞中hdac2基因的敲除，打靶准确、敲除效率高；其次，本发明利用所述sgrna通过crispr-cas9技术构建并筛选获得了一株hdac2基因的敲除，且能显著抑制pprv的复制的单克隆细胞系ve ro-ko-hdac2，所述单克隆细胞系于2024年4月17日送往中国典型培养物保藏中进行保藏，分类命名为绿猴肾细胞vero-ko-hdac2，保藏编号：cctcc no：c2024114，保藏地址：中国武汉，武汉大学；所述绿猴肾细胞vero-ko-hdac2细胞形态与vero细胞相似，呈近圆形，细胞折光性强，胞质饱满，核质清晰；适合在含10％胎牛血清的dmem/f12培养基中生长，且细胞传至30代以上仍可稳定沉默hdac2基因，并不表达hdac2蛋白，稳定性良好；所述的绿猴肾细胞vero-ko-hdac2能够显著抑制pprv的复制，为筛选或制备抑制小反刍兽疫病毒增殖的药物以及为研究小反刍兽疫病毒复制机制或抗小反刍兽疫病毒育种提供了新思路。