工程化蛋白、递送系统及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体地，涉及工程化蛋白、递送系统及其应用。

背景技术：

1、自复制mrna(sarna)技术是新一代mrna技术，基于该技术开发的新冠病毒疫苗(arct-154)已于2023年在日本被批准上市使用。通常，自复制mrna(包括获批的arct-154疫苗)都选用来源于甲病毒复制子系统，基于甲病毒的自复制mrna序列主要包含以下几部分结构元件：(ⅰ)5’端帽子；(ⅱ)甲病毒5’端非编码区核酸序列；(ⅲ)甲病毒非结构蛋白核酸序列，即甲病毒rna复制酶核酸序列(ns1-ns2-ns2-ns4),可翻译合成甲病毒复制酶；(ⅳ)甲病毒26s启动子核酸序列，引导亚基因组mrna的转录及目的蛋白翻译合成；(ⅴ)甲病毒3’端非编码区核酸序列；(ⅵ)3’端polya尾巴。

2、在细胞内，自复制mrna可以利用自身其携带的rna复制酶核酸序列为模板翻译合成rna复制酶，在此基础上，该rna复制酶以自复制mrna序列作为模板转录多拷贝的子代自复制mrna，实现自复制mrna序列的大量扩增。同时，甲病毒复制子的自复制mrna序列中，编码目的蛋白的基因被置于26s启动子下游，rna复制酶可以识别26s启动子并转录出更多数量的含有编码目的蛋白基因的亚基因组mrna，亚基因组mrna利用宿主细胞的蛋白翻译系统大量翻译合成目的蛋白。因此，基于甲病毒复制子的自复制mrna系统比非复制mrna系统具有更高的mrna模板数量、蛋白表达水平，以及更长的表达持续期，被誉为最具有应用前景的下一代mrna技术之一。

3、获批上市的arct-154新冠病毒疫苗采用脂质体纳米颗粒(lnp)递送系统，但是，由于lnp递送系统存在递送效率不高以及缺乏递送组织靶向性问题，制约了自复制mrna生物医药领域的进一步应用。

4、细胞外囊泡(extracellular vesicle、ev)是一种新型rna递送载体，自细胞囊泡运输的调节机制在2013年获得诺贝尔生理或医学奖后，ev逐步成为全球生物医学领域研究的热点方向。

5、细胞外囊泡是由细胞分泌的、由脂质双层包裹的，一种异质性的膜结构群，内含细胞分泌的微小粒子。所有细胞，原核生物和真核生物，均会释放细胞外囊泡。细胞外囊泡大致可分为三大类：外泌体(exosomes)是一种较小的囊泡，直径约为50～150nm，具有内泌体来源；微囊泡(microvesicles)是一种较大的囊泡，直径在50～500nm到1000nm之间，由细胞膜的脱落形成，可通过细胞膜上的突起成熟并分离出来；凋亡体(apoptotic bodies)是由细胞死亡过程中形成的较大的囊泡，直径大于1000nm，当细胞进入凋亡过程时，它们会释放这些囊泡。

6、细胞外囊泡可以携带多种生物活性分子，如核酸(rna和dna)、蛋白质和代谢产物，在细胞间通讯和信号传递等许多生物学过程中发挥重要作用，可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。除此之外，细胞外囊泡可以人工装载小分子、核酸以及蛋白多肽等药物，并能够将生物活性分子运输到受体细胞，因而在载药领域具有强大的应用潜能。

7、相比于人工合成的纳米载体(包括lnp递送载体)，细胞外囊泡在作为递送载体方面具有诸多优势。首先，细胞外囊泡衍生于细胞，在药物递送结束后更容易被代谢；其次，细胞外囊泡展现了更低的免疫原性，避免引起不需要的免疫反应、耐受性良好、重复注射；此外，细胞外囊泡可跨越诸如血脑屏障等其他纳米载体难以逾越的体内屏障。基于其表面配体呈递富集，细胞外囊泡也可使受体介导的组织靶向的发展成为可能。工程化外泌体上的配体富集也可用于诱导或抑制受体细胞中的信号事件或将外泌体靶向特定的细胞类型。

8、细胞外囊泡装载小rna或非复制mrna已有众多的文献报道，其中部分药物已进入临床试验阶段，但是目前鲜有利用细胞外囊泡主动装载自复制mrna的公开报道。细胞外囊泡主动装载自复制mrna面临更多技术挑战。

9、显然易见的，最简单的装载自复制mrna的细胞外囊泡递送系统可通过下述两种方法实现：1)首先分别制备细胞外囊泡和自复制mrna，然后在通过电穿孔的方式将自复制mrna装载至细胞外囊泡之中；2)在细胞内表达自复制mrna、外泌体骨架蛋白和\或病毒膜蛋白，细胞能够自组装形成装载有自复制mrna的细胞外囊泡。虽然上述两种方法在理论上可以装载自复制rna，但是实际上装载效果并不理想，其中最主要的一个因素在于自复制rna序列长度通常是非复制mrna序列长度的3～4倍，难以有效被装载至细胞外囊泡。因此，将甲病毒复制子系统与细胞外囊泡递送系统的有机结合并非如想象的那么简单，需要对甲病毒及甲病毒复制子进行更深入的研究，并对细胞外囊泡递送系统进行更精细的设计。

10、rna结合蛋白(rna binding protein，rbp)是一类重要的蛋白质，rbp通过识别特殊的rna结合域与rna互作。在rna病毒中，病毒衣壳蛋白是一种rbp，可以识别病毒rna的rna包装信号并将病毒rna包装在病毒衣壳之中，其中与病毒rna包装信号相互作用的病毒衣壳蛋白多肽即为rna结合多肽。慢病毒的tat肽是一种典型的rna结合多肽，在外泌体载体中通常被用来特异性包装非复制mrna。

11、甲病毒是一类由蚊虫等节肢动物传播的、有囊膜、单链、正义rna病毒，属于披膜病毒科(togaviridae)，能广泛感染人、鸟、鼠、马等多种动物并引起相关疾病。甲病毒具有两种结构蛋白，衣壳蛋白(c)和膜蛋白(e)，甲病毒c蛋白也是一种rna结合蛋白，可以特异性识别并结合同种病毒的rna并聚合形成病毒衣壳。甲病毒c蛋白的包括两个结构域，n端结构域和c端结构域。甲病毒的rna结合位点主要位于c蛋白的n端结构域，甲病毒的rna包装信号主要位于甲病毒rna的非结构蛋白编码区。

12、基于甲病毒复制子的自复制mrna含有甲病毒非结构蛋白编码区核酸序列，因此，利用甲病毒c蛋白的n端结构域多肽特异性识别自复制mrna的特点，将甲病毒c蛋白的n端结构域多肽或其截短体融合在细胞跨膜蛋白上以形成工程化蛋白。该工程化蛋白具有下列特点：1)可以特异性结合自复制mrna，具有主动包装自复制mrna的性能；2)可以通过细胞跨膜蛋白上的跨膜区使自复制mrna锚定在细胞膜表面，具有促进形成细胞外囊泡的性能；3)可以通过细胞跨膜蛋白上的受体结合位点特异性识别宿主细胞受体，具有增强自复制mrna组织靶向性递送的性能；4)可以通过细胞跨膜蛋白上的融合位点促进膜融合，具有增强自复制mrna递送效率的性能。

13、由于上述工程化蛋白是甲病毒自复制mrna的天然结合蛋白，与其他rna结合蛋白相比具有更好的结合能力，因此，利用上述工程化蛋白制备的递送载体具有更好的包装甲病毒自复制mrna的效果，有望解决细胞外囊泡包装自复制mrna的难题。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

2、因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种工程化蛋白。根据本发明的实施例，所述工程化蛋白包括：rna结合多肽和细胞跨膜蛋白，所述rna结合多肽的c端与所述细胞跨膜蛋白的n端相连，或所述细胞跨膜蛋白的c端与所述rna结合多肽的n端相连，或所述rna结合多肽插入在所述细胞跨膜蛋白的胞内区形成融合蛋白，其中，所述rna结合多肽选自甲病毒c蛋白n端结构域多肽、甲病毒c蛋白n端结构域的截短体多肽和甲病毒c蛋白n端结构域的突变体多肽，所述细胞跨膜蛋白选自动物细胞膜蛋白、外泌体骨架蛋白、包膜病毒膜蛋白和其突变体多肽中的至少之一。

3、根据本发明的实施方案，上述工程化蛋白还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：

4、根据本发明的实施方案，所述甲病毒包括选自下列中的至少之一：sinv、veev和sfv。

5、根据本发明的实施方案，所述rna结合多肽包括veev的c蛋白第1～124位的氨基酸序列或其截短体多肽。

6、根据本发明的实施方案，所述rna结合多肽包括seq id no：1～3中任一项所示的氨基酸序列。

7、kkkknggkkkaktgppnpkaqsgnkkkpnkkpgkrqrmvmklesd(seq id no：1)。

8、kkkknggkkkaktgppnpk(seq id no：2)。

9、kpgkrqrmvmklesd(seq id no：3)。

10、根据本发明的实施方案，所述rna结合多肽包括sinv的c蛋白第1～113位的氨基酸序列或其截短体多肽。

11、根据本发明的实施方案，所述rna结合多肽包括seq id no：4或5中任一项所示的氨基酸序列。

12、kpkkpktgekkkkgpakpkpgkrgrmalklead(seq id no：4)。

13、kpkkpktgekkkkgpakp(seq id no：5)。

14、根据本发明的实施方案，所述rna结合多肽包括sfv的c蛋白第1～118位的氨基酸序列或其截短体多肽。

15、根据本发明的实施方案，所述rna结合多肽包括seq id no：6或7所示的氨基酸序列。

16、kkingktqqqkkkdkqadkkkkkpgkrermcmkiend(seq id no：6)。

17、kkingktqqqkkkdkqadkkkk(seq id no：7)。

18、根据本发明的实施方案，所述动物细胞膜蛋白包括选自下列中的至少之一：细胞受体蛋白和细胞融合蛋白。

19、根据本发明的实施方案，所述细胞受体蛋白包括选自下列中的至少之一：选择素e、pdgfr、cd6、cd14、cd11b、cd36、cd3、cd4、cd8和cd28。

20、根据本发明的实施方案，所述细胞融合蛋白包括选自下列中的至少之一：myomaker、mymerger和syncytin。

21、根据本发明的实施方案，所述外泌体骨架蛋白包括选自下列中的至少之一：lamp2b、cd9、cd37、cd63、cd64、cd81、cd82、arrdc1和spfh。

22、根据本发明的实施方案，所述包膜病毒膜蛋白包括选自下列中的至少之一：甲病毒糖蛋白e、水泡性口炎病毒糖蛋白g、麻疹病毒糖蛋白h/f、风疹病毒糖蛋白e、腮腺炎病毒糖蛋白ha/na、狂犬病毒糖蛋白g、流感病毒糖蛋白ha/na、副流感病毒糖蛋白nh/f、呼吸道合胞病毒糖蛋白g/f、乙型脑炎病毒糖蛋白e和仙台病毒hn/f。

23、根据本发明的实施方案，所述工程化蛋白包括：veev的c蛋白多肽和lamp2b。

24、根据本发明的实施方案，所述veev的c蛋白多肽的n端与lamp2b的c端相连。

25、根据本发明的实施方案，所述工程化蛋白具有seq id no：8所示的氨基酸序列。

26、mglqlnitqdkvasvininpntthstgscrshtallrlnsstikyldfvfavknenrfylkevnvs mylvngsvfsiannnlsywdaplgssymcnkeqtvsvsgafqintfdlrvqpfnvtqgkystaqecsl dddtilipiivgaglsgliiviviayvigrrksyagyqtlkkkknqqkkkaktgppnpk(seq id no：8)。

27、根据本发明的实施方案，所述工程化蛋白包括：veev的c蛋白多肽和cd11b。

28、cd11b属于cd11抗原样家族成员，也被称作整合素alpha m(itgam)，参与单核细胞、巨噬细胞和粒细胞的各种黏附相互作用，调节中性粒细胞迁移、激活与凋亡。同时，cd11b与肿瘤相关，是肿瘤免疫治疗的一个新靶点，有研究表明激活蛋白cd11b有助于抑制肿瘤的生长。cd11b是巨噬细胞及小胶质细胞的表面标记物，虽然在生理条件下，巨噬细胞及小胶质细胞来源的外泌体中检测出了cd11b蛋白，但是到目前为止，很少有利用cd11b蛋白作为骨架蛋白产生工程化外泌体的研究报道。

29、根据本发明的实施方案，所述veev的c蛋白多肽的n端与cd11b的c端相连。

30、根据本发明的实施方案，所述工程化蛋白具有seq id no：9所示的氨基酸。

31、malrvllltaltlchgfnldtenamtfqenargfgqsvvqlqgsrvvvgapqeivaanqrgslyqcdystgscepirlqvpveavnmslglslaattsppqllacgptvhqtcsentyvkglcflfgsnlrqqpqkfpealrgcpqedsdiaflidgsgsiiphdfrrmkefvstvmeqlkksktlfslmqyseefrihftfkefqnnpnprslvkpitqllgrthtatgirkvvrelfnitngarknafkilvvitdgekfgdplgyedvipeadregviryvigvgdafrseksrqelntiaskpprdhvfqvnnfealktiqnqlrekifaiegtqtgssssfehemsqegfsaaitsngpllstvgsydwaggvflytskekstfinmtrvdsdmndaylgyaaaiilrnrvqslvlgapryqhiglvamfrqntgmwesnanvkgtqigayfgaslcsvdvdsngstdlvligaphyyeqtrggqvsvcplprgqrarwqcdavlygeqgqpwgrfgaaltvlgdvngdkltdvaigapgeednrgavylfhgtsgsgispshsqriagsklsprlqyfgqslsggqdltmdglvdltvgaqghvlllrsqpvlrvkaimefnprevarnvfecndqvvkgkeagevrvclhvqkstrdrlregqiqsvvtydlaldsgrphsravfnetknstrrqtqvlgltqtcetlklqlpnciedpvspivlrlnfslvgtplsafgnlrpvlaedaqrlftalfpfekncgndnicqddlsitfsfmsldclvvggprefnvtvtvrndgedsyrtqvtfffpldlsyrkvstlqnqrsqrswrlacesasstevsgalkstscsinhpifpensevtfnitfdvdskaslgnklllkanvtsennmprtnktefqlelpvkyavymvvtshgvstkylnftasentsrvmqhqyqvsnlgqrslpislvflvpvrlnqtviwdrpqvtfsenlsstchtkerlpshsdflaelrkapvvncsiavcqriqcdipffgiqeefnatlkgnlsfdwyiktshnhllivstaeilfndsvftllpgqgafvrsqtetkvepfevpnplplivgssvggllllalitaalyklgffkrqykdmmseggppgaepqkkkknqqkkkaktgppnpk(seq id no：9)。

32、根据本发明的实施方案，所述工程化蛋白包括veev的c蛋白多肽和sinv糖蛋白e2。

33、根据本发明的实施方案，所述sinv的e2删除了第397～414位的氨基酸序列。

34、根据本发明的实施方案，所述veev的c蛋白多肽插入至sinv的e2的第396位氨基酸后。

35、根据本发明的实施方案，所述工程化蛋白具有seq id no：10所示的氨基酸序列。

36、sviddftltspylgtcsychhtvpcfspvkieqvwdeaddntiriqtsaqfgydqsgaasankyrymslkqdhtvkegtmddikistsgpcrrlsykgyfllakcppgdsvtvsivssnsatsctlarkikpkfvgrekydlppvhgkkipctvydrlkettagyitmhrprphaytsyleessgkvyakppsgknityeckcgdyktgtvstrteitgctaikqcvayksdqtkwvfnspdlirhddhtaqgklhlpfklipstcmvpvahapnvihgfkhislqldtdhltllttrrlganpepttewivgktvrnftvdrdgleyiwgnhepvrvyaqesapgdphgwpheivqhyyhrhpvytilavasatvammigvtvavlcackarreckkkknqqkkkaktgppnpklccvrsana(seq id no：10)。

37、根据本发明的实施方案，所述工程化蛋白包括veev的c蛋白多肽和vsv糖蛋白g。

38、根据本发明的实施方案，所述veev的c蛋白多肽n端与vsv糖蛋白g的c端相连。

39、根据本发明的实施方案，所述工程化蛋白具有seq id no：11所示的氨基酸序列。

40、ckftivfphnqkgnwknvpsnyhycpsssdlnwhndligtglqvkmpkshkaiqadgwmchaskwvttcdfrwygpkyithsirsftpsveqckesieqtkqgtwlnpgfppqscgyatvtdaeavivqvtphhvlvdeytgewvdsqfingkcsndicptvhnsttwhsdykvkglcdsnlistditffsedrelsslgkegtgfrsnyfayetgdkackmqyckhwgvrlpsgvwfemadkdlfaaarfpecpegssisapsqtsvdvsliqdverildyslcqetwskiraglpispvdlsylapknpgtgpaftiingtlkyfetryirvdiaapilsrmvgmisgttterelwddwapyedveigpngvlrtssgykfplymighgmldsglhlsskaqvfehphiqdaasqlpddeilffgdtglsknpidfvegwfsswkssiasfffiigliiglflvlrvgiylyiklkhtkkrqiytdiemnrlgrkkkknqqkkkaktgppnpk(seq idno：11)。

41、在本发明的第二方面，本发明提出了一种递送载体。根据本发明的实施方案，所述递送载体携带第一方面所述的工程化蛋白和/或编码所述工程化蛋白的核酸序列。所述递送载体可将甲病毒自复制mrna和\或编码所述工程化蛋白的核酸序列递送至细胞内或体内。

42、根据本发明的实施方案，上述递送载体还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：

43、根据本发明的实施方案，所述递送载体包括选自下列中的至少之一：细胞外囊泡、病毒、核酸蛋白复合物、质粒、rna和细胞。

44、根据本发明的实施方案，所述递送载体为细胞外囊泡，所述细胞外囊泡还包括细胞膜泡和甲病毒自复制mrna。所述细胞外囊泡可将甲病毒自复制mrna递送至细胞内或体内。

45、根据本发明的实施方案，所述细胞膜泡来源于动物细胞。

46、根据本发明的实施方案，所述工程化蛋白装载在所述细胞膜泡上。

47、根据本发明的实施方案，所述甲病毒自复制mrna携带甲病毒rna包装信号，其通过甲病毒rna包装信号与rna结合多肽进行特异性结合，被包装在所述细胞膜泡之中，从而形成所述细胞外囊泡。

48、根据本发明的实施方案，所述甲病毒自复制mrna包括：5’端帽子、甲病毒5’端非编码区核酸序列、甲病毒非结构蛋白核酸序列、甲病毒26s启动子、编码目的蛋白的核酸序列、甲病毒3’端非编码区核酸序列和3’端polya尾巴。

49、根据本发明的实施方案，所述细胞外囊泡包括seq id no：8～11任一项所示的氨基酸序列或29、32、35、45、47、53、55任一项所示的氨基酸序列。

50、根据本发明的实施方案，所述递送载体为病毒，所述病毒还包括甲病毒自复制mrna。由此，所述病毒可将编码所述工程化蛋白的核酸序列和/或甲病毒自复制mrna递送至细胞内或体内。

51、根据本发明的实施方案，所述工程化蛋白装载在所述病毒的囊膜上。

52、根据本发明的实施方案，所述病毒选自非复制缺陷病毒或复制缺陷病毒。

53、根据本发明的实施方案，所述病毒包括选自下列中的至少之一：单纯疱疹病毒、痘病毒、腺病毒、甲病毒、黄病毒、流感病毒、冠状病毒、狂犬病毒、水泡性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒。

54、根据本发明的实施方案，所述病毒为甲病毒。

55、根据本发明的实施方案，所述甲病毒选自veev。

56、根据本发明的实施方案，所述veev基因组删除了c蛋白基因和/或e蛋白基因。

57、根据本发明的实施方案，所述病毒具有seq id no：11所示的氨基酸序列。

58、本发明的有益效果至少在于：在自复制mrna递送载体中，将识别甲病毒rna包装信号的rna结合多肽引入到细胞跨膜蛋白的胞内区，通过rna结合多肽与rna包装信号的特异性结合，实现了递送载体对自复制mrna的主动装载。在细胞外囊泡递送载体中，所述的这种自复制mrna主动装载系统，还能提升细胞外囊泡对自复制mrna的包装效率，扩大了递送载体的递送靶向范围，解决了细胞外囊泡装载自复制mrna的特异性问题。

59、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。