一种快速检测抗菌药物敏感性的AIE试剂及方法

本发明涉及细菌敏感性检测，具体涉及一种快速检测抗菌药物敏感性的aie试剂及方法。

背景技术：

1、抗生素的广泛使用，细菌产生耐药性的速度逐渐加快，使得药物选择困难。细菌耐药性快速检测技术是应对全球公共卫生挑战的重要手段，目前临床微生物实验室使用的抗菌药物敏感性实验主要包括纸片扩散法、稀释法、e-test法等。这些方法都是通过肉眼观察细菌的生长情况，需要细菌生长到一定的数量，最少需要12小时甚至更长的时间。自动化细菌药敏检测系统在一定层度上提高了检测速度，但是这些仪器普遍采用比浊法观测细菌数量的动力变化，受限于比浊法的低灵敏度，也需要8h左右才能给出药敏结果，并且这些仪器成本较高，基层医院使用受限。因此，需要开发出对设备要求低、能在更短的时间里给出药敏检测结果且满足mic（最小抑菌浓度）需求的快速检测方法，能够为抗菌治疗快速提供解决方案。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速检测抗菌药物敏感性的aie试剂及方法。

2、本发明首先提供一种aie分子（包括aie-1分子，还可以包括aie-2分子）在体外抗菌药物敏感性检测中的应用，用于判断抗菌药物的敏感性，以及测定抗菌药物的最小抑菌浓度（mic值）。

3、其次，本发明提供一种快速检测抗菌药物敏感性的aie试剂，用于体外抗菌药物敏感性试验，灵敏度高、荧光背景低且光稳定性好，能够在更短时间内得出药敏检测结果，快速判断抗菌药物的敏感性，准确测定mic值。

4、最后，本发明提供一种快速检测抗菌药物敏感性的方法。

5、本发明的目的通过以下技术方案实现：

6、本发明提供一种aie分子在体外抗菌药物敏感性检测中的应用，所述aie分子包括aie-1分子，所述aie-1分子选自式1中的至少一种；

7、

8、式1

9、式1中，r各自独立选自氢、氨基、具有1～20个碳原子的烷基、具有2～20个碳原子的不饱和烃基、具有1～20个碳原子的杂烷基、具有3～20个碳原子的环烷基、具有2～20个碳原子的杂环烷基、具有6～30个碳原子的芳基和具有5～30个碳原子的杂芳基；

10、r1选自以下结构中的一种：

11、

12、

13、z为阴离子；

14、r2选自以下结构中的一种：

15、

16、n1为1-5的整数（1、2、3、4、5）。

17、优选的，式1中，所述杂烷基包括烷氧基或烷氨基；

18、优选的，式1中，所述阴离子为卤离子（氟离子、氯离子、溴离子、碘离子等）、no2-、bf4-、bf6-、no3-、po43-、so32-中的至少一种。

19、优选的，所述aie-1分子选自、中的至少一种。

20、优选的，所述aie分子还包括aie-2分子；所述aie-2分子选自式2中的至少一种；

21、

22、式2

23、式2中，r1、r2、r3、r4、r5各自独立的选自取代或未取代的具有1～20个碳原子的直链烷基、取代或未取代的具有3～20个碳原子的支链烷基、取代或未取代的具有3～20个碳原子的环烷基；

24、n2为2-10的整数（2、3、4、5、6、7、8、9、10）；

25、x-为阴离子。

26、进一步优选的，式2中，所述阴离子为卤离子（氟离子、氯离子、溴离子、碘离子等）、no2-、bf4-、bf6-、no3-、po43-、so32-中的至少一种；

27、进一步优选的，式2中，所述取代或未取代的具有1～20个碳原子的直链烷基、取代或未取代的具有3～20个碳原子的支链烷基、取代或未取代的具有3～20个碳原子的环烷基中的取代基为-cooh、-oh、-nh2、-cho、-cn或-no2。

28、进一步优选的，所述aie-2分子选自、中的至少一种。

29、进一步优选的，所述aie-1分子与aie-2分子的摩尔比为1:（5~10）。

30、优选的，本发明所述aie分子在体外抗菌药物敏感性检测中用于测定抗菌药物的最小抑菌浓度和判断抗菌药物的敏感性。

31、本发明提供一种快速检测抗菌药物敏感性的aie试剂，包括aie分子；所述aie分子包括上述的aie-1分子。

32、优选的，所述快速检测抗菌药物敏感性的aie试剂的aie分子还包括上述的aie-2分子。

33、进一步优选的，所述aie-1分子与aie-2分子的摩尔比为1:（5~10）。

34、优选的，所述快速检测抗菌药物敏感性的aie试剂还包括溶剂。所述溶剂优选为水、二甲基亚砜、n，n-二甲基甲酰胺中的任意一种。

35、本发明提供一种上述快速检测抗菌药物敏感性的aie试剂在体外抗菌药物敏感性检测中的应用。

36、本发明提供一种快速检测抗菌药物敏感性的方法，包括以下步骤：

37、（1）制备菌液，加入上述的aie试剂，混合均匀，得含aie试剂的混合菌液；

38、（2）梯度稀释配制不同梯度浓度的待测抗菌药物溶液，分别加入步骤（1）的混合菌液，得检测液，进行细菌培养，监测不同时间点的荧光值；

39、分别计算不同抗菌药物浓度下培养时间n小时的相对荧光强度fn=(in-i0）/i0，其中，in为培养时间n小时的荧光值，i0为培养时间0小时的初始荧光值；

40、（3）分别拟合不同抗菌药物浓度下的fn与时间的线性关系，确定直线斜率，通过将抗菌药物浓度为a时的直线斜率ka与抗菌药物浓度为0时的直线斜率k0进行比较，确定抗菌药物的最小抑菌浓度，判断抗菌药物敏感性；

41、随抗菌药物浓度提高，当首次斜率ka≤0.01时，该斜率对应的抗菌药物浓度a确定为该抗菌药物的最小抑菌浓度。

42、优选的，步骤（2）中，所述检测液中，菌的浓度为0.5麦氏浊度~0.5麦氏浊度稀释1000倍之间的任意浓度，aie分子的浓度为5-12μm；

43、进一步优选的，aie分子为aie-1分子时，步骤（2）所述检测液中aie-1分子的浓度为5-10μm；

44、进一步优选的，aie分子为aie-1分子和aie-2分子时，步骤（2）所述检测液中aie分子-1的浓度为1-2μm，aie分子-2的浓度为5-10μm。

45、优选的，步骤（2）中所述细菌培养的条件为适宜细菌生长的条件。

46、优选的，所述荧光值可以采用任何具有发光检测功能的仪器进行监测。优选酶标仪直接进行实时培养和监测。

47、优选的，所述待测抗菌药物溶液梯度稀释浓度参照clsi（美国临床和实验室标准协会）标准。

48、作为优选的一种实施方式，所述的快速检测抗菌药物敏感性的方法，包括以下步骤：

49、（1）将菌种在平板培养皿上30-37℃培养15-20 h，挑取平板单菌落，用培养基制备成0.5麦氏浊度菌液，再稀释0-500倍备用；

50、将aie分子加入超纯水溶解，制备aie分子浓度为5-12mm的aie试剂；

51、将aie试剂加入菌液中混合均匀，制备含aie分子终浓度为10-24μm的混合菌液；

52、（2）将抗菌药物储液按梯度稀释配制不同梯度浓度的待测抗菌药物溶液，每个梯度按100 μl/孔分装至96孔微孔板；再按100 μl/孔将步骤（1）的混合菌液分装至 96孔微孔板的待测抗菌药物溶液中，得若干个不同梯度浓度的抗菌药物检测液；96孔板制备完毕后置于荧光读取仪器中定时监测，设置激发波长460nm，发射波长560nm；

53、分别计算不同抗菌药物浓度下培养时间n小时的相对荧光强度fn=(in-i0）/i0，其中，in为培养时间n小时的荧光值，i0为培养时间0小时的初始荧光值；

54、（3）分别拟合不同抗菌药物浓度下的fn与时间的线性关系，确定直线斜率，通过将抗菌药物浓度为a时的直线斜率ka与抗菌药物浓度为0时的直线斜率k0进行比较，确定抗菌药物的最小抑菌浓度，判断抗菌药物敏感性；

55、随抗菌药物浓度提高，当首次斜率ka≤0.01时，该斜率对应的抗菌药物浓度a确定为该抗菌药物的最小抑菌浓度。

56、本发明具有以下有益效果：

57、1、本发明提供aie分子（包括aie-1分子，还可以包括aie-2分子）在体外抗菌药物敏感性试验中的应用。本发明创造性的发现，aie-1分子能够用于体外抗菌药物敏感性试验，灵敏度高、荧光背景低且光稳定性好，能够在更短时间内得出药敏检测结果，快速判断抗菌药物的敏感性，且能够准确测定抗菌药物的最小抑菌浓度（mic值）。

58、2、本发明的快速检测抗菌药物敏感性的aie试剂，相比于现有技术，具有更低的荧光背景和较好的光稳定性（长时间监测不会出现荧光猝灭），可以直接将试剂加入药敏测试稀释液中，实时进行细菌生长的长时间监测；检测灵敏度高，通过细菌生长曲线，快速得出药敏结果且满足mic值测定的需求。

59、3、本发明的快速检测抗菌药物敏感性的方法，能够在8h内获取药敏试验结果，且准确判断抗菌药物的mic值，适用于不同的培养基，且检测设备的要求低（采用普通的具有发光检测功能的多功能读板机就能实现监测），大大提高了体外抗菌药物敏感性试验的效率，能够为抗菌治疗快速提供解决方案。