类胡萝卜素φ环合酶及其在构建合成异海绵烯工程菌株中的应用

本发明属于生物工程和合成生物学领域，涉及类胡萝卜素环合酶及其编码的蛋白和应用，具体涉及在合成异海绵烯(isorenieratene)巴斯德毕赤酵母工程菌株中的应用。

背景技术：

1、巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养酵母，具有很强的呼吸代谢能力，因此能在简单培养基中生长到非常高的细胞密度，也可以很容易地从摇瓶扩大到大规模生物反应器。巴斯德酵母的综合特性使该菌株在生产类胡萝卜素等化合物方面具有巨大的潜力。最近的研究已经证明，巴斯德氏菌适合于生产透明质酸、类胡萝卜素和倍半萜(+)-诺卡酮等天然产物。与其他微生物相比，巴斯德毕赤酵母安全可靠，可用于食品、医药等众多行业；菌株生长速度快，抗逆性强，培养简单，适合工业化；分子操作平台成熟且遗传工具完善，发展前景广阔。

2、异海绵烯是一种含苯环端基的稀有类胡萝卜素，其两端的芳香环能够与对称的异戊二烯碳链形成共轭大π键，该结构赋予其更强的稳定性，并且在具有高抗氧化能力的同时，异海绵烯还可以有效吸收紫外辐射，因此具有细胞光保护作用。作为一种结构更稳定、功能更优的类胡萝卜素，异海绵烯在功能食品以及医药等领域展示出巨大的应用潜力。异海绵烯的生物合成主要是通过类胡萝卜素环合酶(crtu)，由β胡萝卜素催化而来。目前，异海绵烯目前只在少部分光合细菌、亚麻短杆菌、链霉菌和红球菌中检测到并且产量较低，所以亟需构建一种能够高效合成异海绵烯的工程菌株。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种类胡萝卜素环合酶基因及其编码蛋白；

2、本发明的另一目的是将类胡萝卜素环合酶应用于异海绵烯的合成；

3、本发明的再一目的在于合成异海绵烯工程毕赤酵母的构建方法；

4、本发明的再一目的是提供一种异海绵烯的鉴定方法；

5、为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

6、类胡萝卜素环合酶，其氨基酸序列如seq id no.6所示。

7、编码类胡萝卜素环合酶的基因序列。

8、编码类胡萝卜素环合酶的基因其核苷酸序列为seq id no.5所示，该基因(从起始密码子到终止密码子)全长1566bp，编码521个氨基酸。

9、类胡萝卜素环合酶基因的获得：

10、通过基因组比对分析的方法来寻找目的基因，首先对食醚红球菌(rhodococcusaetherivorans)的基因组进行ncbi注释，寻找注释为假定的类胡萝卜素环合酶基因的基因，从食醚红球菌中克隆该基因，本发明通过功能验证确定其具有类胡萝卜素环合酶，将具有类胡萝卜素环合酶功能的基因用于后续合成异海绵烯毕赤酵母工程菌株的构建。

11、所述类胡萝卜素环合酶在异海绵烯合成中的应用。

12、将所述类胡萝卜素环合酶基因导入到宿主菌中，发酵生产异海绵烯。

13、一株生产异海绵烯的菌株，向巴斯德毕赤酵母中导入香叶基香叶基二磷酸合酶crte、八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶crtyb、八氢番茄红素去饱和酶crti、3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶thmgr和类胡萝卜素环合酶crtu的表达盒得到；所述crte的编码基因序列如seq id no.1所示；所述crtyb的编码基因序列如seq id no.2所示；所述crti的编码基因序列如seq id no.3所示；所述thmgr的编码基因序列如seq id no.4所示；所述crtu的编码基因序列如seq id no.5所示。

14、本发明中，所述香叶基香叶基二磷酸合酶crte、八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶crtyb、八氢番茄红素去饱和酶crti的基因来源于红法夫酵母(xanthophyllomycesdenrorhous)；所述3-羟基-3-甲基戊二酰coa还原酶的基因来源于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)；所述类胡萝卜素环合酶基因crtu来源于食醚红球菌(rhodococcus aetherivorans)。

15、所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母gs115。

16、作为一种优选的实施方式，所述表达盒的启动子为巴斯德毕赤酵母的pgpm1启动子、ppdc1启动子、pmdh3启动子、padh2启动子或pgap启动子；所述终止子为巴斯德毕赤酵母的sccyc1tt终止子、rpp1btt终止子、rps2tt终止子、rpl2att终止子或rps3tt终止子。

17、作为一种优选的实施方式，所述重组巴斯德毕赤酵母还表达1个标记基因；所述标记基因选自质粒bb3ak-af的硫酸卡那霉素编码基因表达盒。

18、进一步优选地，crti启动子为pgpm1，终止子为sccyc1tt；crte的启动子为ppdc1启动子，终止子为rpp1btt；crtyb的启动子为pmdh3，终止子为rps2tt；thmgr的启动子为padh2，终止子为rpl2att；crtu的启动子为pgap，终止子为rps3tt该质粒携带的硫酸卡那霉素基因用作巴斯德毕赤酵母的筛选标记。

19、本发明的另一目的在于提供上述菌株的构建方法，将所述crte、crtyb、crti以及thmgr的表达盒通过质粒形式导入所述巴斯德毕赤酵母gs115，整合在巴斯德毕赤酵母菌株基因组上。

20、包括：

21、将所述crte、crtyb、crti、thmgr和crtu的基因片段通过goldengate方法插入质粒bb1-23中，得到质粒bb1-23-crte、bb1-23-crtyb、bb1-23-crti、bb1-23-thmgr和bb1-23-crtu；

22、将所述质粒bb1-23-crti与质粒bb1-12-pgpm1、质粒bb1-34-sccyc1tt通过goldengate方法插入质粒bb2-ab中，得到质粒bb2-ab-pgpm1-crti-sccyc1tt；

23、将所述质粒bb1-23-crte与质粒bb1-12-ppdc1、质粒bb1-34-rpp1btt通过goldengate方法插入质粒bb2-bc中，得到质粒bb2-bc-ppdc1-crte-rpp1btt；

24、将所述质粒bb1-23-crtyb与质粒bb1-12-pmdh3、质粒bb1-34-rps2tt通过goldengate方法插入质粒bb2-cd中，得到质粒bb2-cd-pmdh3-crtyb-rps2tt；

25、将所述质粒bb1-23-thmgr与质粒bb1-12-padh2、质粒bb1-34-rpl2att通过goldengate方法插入质粒bb2-de中，得到质粒bb2-de-padh2-thmgr-rpl2att；

26、将所述质粒bb1-23-crtu与质粒bb1-12-pgap、质粒bb1-34-rps3tt通过goldengate方法插入质粒bb2-ef中，得到质粒bb2-ef-pgap-crtyb-rps3tt；

27、将所述质粒bb2-ab-pgpm1-crti-sccyc1tt、bb2-bc-ppdc1-crte-rpp1btt、bb2-cd-pmdh3-crtyb-rps2tt、bb2-de-padh2-thmgr-rpl2att和bb2-ef-pgap-crtyb-rps3tt通过goldengate方法插入质粒bb3ak-af中，得到质粒bb3ak-af-l8crtu；

28、将所述质粒bb3ak-af-l8crtu导入巴斯德毕赤酵母gs115，获取重组菌株。

29、使用bpi1酶和t4连接酶通过goldengate方法构建所述bb2-ab-pgpm1-crti-sccyc1tt、bb2-bc-ppdc1-crte-rpp1btt、bb2-cd-pmdh3-crtyb-rps2tt、bb2-de-padh2-thmgr-rpl2att、和bb2-ef-pgap-crtyb-rps3tt质粒。

30、使用bsa1酶和t4连接酶通过goldengate方法构建所述bb3ak-af-l8crtu质粒。

31、生产异海绵烯的重组菌株在生产类胡萝卜素中的应用。

32、所述重组菌株在生产异海绵烯中的应用。

33、所述应用包括：在25～35℃条件下，将重组菌接种到营养培养基中，发酵培养3～8天，得到发酵产物；

34、所述营养培养基为：10g/l葡萄糖，20g/l蛋白胨和10g/l酵母粉；

35、所述菌株培养温度优选为30℃，发酵时间为4～5天。

36、在50ml的摇瓶发酵中，最高可以生产159.41mg/l的异海绵烯产量和9.43mg/g的异海绵烯含量。

37、采用二甲基亚砜和丙酮萃取所述发酵产物，得到异海绵烯。

38、提取方法包括如下步骤：取2ml发酵液，12000rpm离心3min，超纯水洗涤两遍，弃掉上清液，加2ml二甲基亚砜，震荡摇匀，55℃水浴15min，加入2ml丙酮，55℃水浴避光静置15min，12000rpm 3min取上清待下一步检测。

39、本发明还提供了一种鉴定重组菌株的产物以及其产量的方法；

40、采用二甲基亚砜和丙酮萃取所述发酵产物，得到异海绵烯，采用lc-ms分析对产物异海绵烯定性检测并通过高效液相色谱检测其产量。

41、液相条件为：

42、色谱柱：c30色谱柱；紫外吸收波长为450nm；进样量10ul；流动相a为甲醇b为甲基叔丁基醚，流速：1ml/min；洗脱程序：第一阶段：采用流动相a和流动相b的混合液洗脱30分钟，其中流动相a的体积百分含量由95％变为70％，流动相b的体积百分含量由5％变为30％；第二阶段：采用流动相a和流动相b的混合液洗脱20分钟，其中流动相a的体积百分含量由70％变为50％，流动相b的体积百分含量由30％变为50％；第三阶段：采用流动相a和流动相b的混合液洗脱10分钟，其中流动相a的体积百分含量由50％变为95％，流动相b的体积百分含量由50％变为5％。

43、质谱条件为：

44、采集模式:mse(低能量/高能量切换扫描)；电喷雾正离子/负离子分别扫描；毛细管电压2kv；锥孔电压40v；雾化气温度:450℃；雾化气流量900l/h；锥孔反吹气50l/h；离子源温度115℃；扫描范围50～1000m/z；扫描速度0.2s；碰撞能量6ev/20～45ev；在线锁定质量；250pg/ul亮氨酸脑啡肽持续进样，流速10ul/min；采集间隔0.5s；采集时间0.5s。

45、有益效果：

46、1.本发明首次证明在毕赤酵母中验证类胡萝卜素环合酶crtu的功能，该基因为一个新功能的基因，全长(从起始密码子到终止密码子)全长1566bp，可编码521个氨基酸。

47、2.本发明首次实现了利用工程巴斯德毕赤酵母利用葡萄糖从头合成异海绵烯。通过利用类胡萝卜素环合酶crtu来构建了能够从头合成异海绵烯的菌株，这也是首次在非天然菌株中合成异海绵烯的报道。

48、3.本发明提供了重组巴斯德毕赤酵母菌株中异海绵烯的提取及其检测方法。