一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌OMVs组合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及疫苗制备，更具体的说是一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌omvs组合物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(apn)引起的一种高度传染性、致死性呼吸道病,以急性出血和慢性的纤维素性坏死性胸膜炎病变为主要特征。本病对各种猪均易感,在新引进猪群多呈急性暴发,其发病率和死亡率常在20％以上,最急性型的死亡率可高达80％～100％。常在群多呈慢性经过,患猪表现慢性消瘦,或继发其它疾病造成急性死亡。无症状的猪或康复猪体内可长期带菌,成为稳定的传染源。猪传染性胸膜肺炎分布广泛。自1957年pattison等首次报道猪传染性胸膜肺炎以来,世界各国均发现有本病流行。由于本病经空气和接触传染,以致越是养猪集约化程度高的国家和地区发病越严重。

2、外膜囊泡(omvs)是革兰氏阴性菌表面分泌的产物，是细菌外膜在一定的机制下发生出芽并在细菌表面形成一种囊泡状的结构，这种结构包括了外膜以及周质成分。外膜囊泡大多数为球形，直径大约在20–250nm之间。1959年，de等首次发现霍乱弧菌滤除细菌后的培养液能够诱导家兔对霍乱弧菌的免疫反应。chatterje等在研究对数生长期霍乱弧菌的超微结构时，发现在液体培养基无菌滤液中有革兰氏阴性菌细胞壁出芽形成的囊泡，而且在外膜容易发生囊泡出芽的位点附近，颗粒物质含量较高，这些颗粒可以随着细胞质进入出芽的囊泡中。omvs的产生代表着细菌具有向外部环境释放大量的，复杂的蛋白组分和磷脂的独特机制。后来的研究发现，几乎所有的革兰氏阴性菌都能产生omvs，其化学结构的组成成分除了外膜蛋白还有其他一些膜结构成分，所以人们将这种膜结构的囊泡称为外膜囊泡。omvs中包含的外膜组分可以刺激机体产生适应性免疫记忆，含有的lps可作为自身佐剂，而且作为非复制性疫苗具一定安全性。所以这些因素促使omvs成为开发非复制性高效疫苗的热门选择。

3、现外膜囊泡多使用超速离心机进行两次超离心来进行提取，因超速离心机处理样品量有限，且操作难度大、成本高，费时费力，不能大量提取外膜囊泡，不适用于产业化生产，而本发明克服了此缺陷，本发明使用中空纤维浓缩系统对样品进行浓缩，可实现大量提取外膜囊泡，同时使用peg浓缩代替两次超速离心，即低了成本又降低了操作难度，使外膜囊泡的大量提取及产业化成为可能。

4、目前，现阶段的猪传染性胸膜肺炎疫苗多为灭活菌疫苗，但菌株制备过程繁琐，成本高，且免疫效果不佳。omvs具有介导dna片段、自溶酶、细胞毒素、毒力因子和多种生物分子转移的特性，omvs的组成使其成为激活宿主先天和获得性免疫应答通路的重要因子。除了强大的免疫调节分子lps外，囊泡还含有om孔蛋白和其他重要的先天免疫激活配体，omv的免疫原性可导致保护性黏膜和全身杀菌抗体反应，已被用于疫苗开发。目前所有实验证据表明，对omv的先天免疫反应是由细菌相关分子模式(pamps)和对lps的识别共同作用的结果。囊泡中的脂蛋白和om蛋白是一种生物活性分子，可以激活免疫细胞并诱导白细胞迁移。

5、因此如何将外膜囊泡应用于猪传染性胸膜肺炎疫苗，提供一种在降低灭活菌体含量的情况下，仍具有显著预防猪传染性胸膜肺炎效果的疫苗，是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌omvs组合物及其制备方法和应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌omvs组合物，所述组合物由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型gz株分泌的omvs和胸膜肺炎放线杆菌7型zq株分泌的omvs组成，所述omvs是具有双层膜结构的囊泡状小体，其携带有细菌外膜和周质成分。

4、本发明的再一目的是提供：一种上述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌omvs组合物的制备方法，包括如下步骤：

5、(1)将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型gz株、7型zq株分别发酵培养8-10h，制备得到1型gz株发酵菌液和7型zq株发酵菌液；

6、(2)分别将上述两种发酵菌液离心分离，取上清液，过中空纤维系统浓缩，制备得到1型gz株上清浓缩液和7型zq株上清浓缩液；

7、(3)取上述两种上清浓缩液按6-14％的量分别加入peg浓缩，静置，离心分离，取沉淀分别加入pbs重悬、过滤，制备得到1型gz株omvs和7型zq株omvs，混合，制得猪传染性胸膜肺炎放线杆菌omvs组合物。

8、优选的，步骤(1)所述发酵培养的条件如下：发酵温度37℃、搅拌转速100-200rpm、ph7.2-7.4、发酵罐压力0.03-0.05pa、发酵时间8～10h。

9、优选的，步骤(1)所述发酵培养的培养基为包含nad和新生牛血清的tsb培养基，所述培养基中nad的终浓度为0.01％，新生牛血清的终浓度为2％。

10、优选的，步骤(2)所述离心分离过程如下：2-8℃，8000rpm，离心15min；所述浓缩采用300kda中空纤维系统浓缩。

11、优选的，步骤(3)所述peg的加入量为上清浓缩液总重量的6-14％，2-8℃下搅拌4h，所述静置的时间为18-24h；离心分离过程如下：12000rpm，4℃，离心30min；所述过滤采用0.22μm滤膜过滤。

12、本发明的再一目的是提供：上述omvs组合物或上述方法制备的omvs组合物在制备猪传染性胸膜肺炎疫苗或疫苗佐剂中的应用。

13、本发明的再一目的是提供：一种猪传染性胸膜肺炎二价灭活omv疫苗，所述二价灭活omv疫苗包括上述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌omvs组合物。

14、优选的，所述二价灭活omv疫苗还包括猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型gz株和7型zq株的灭活菌株。

15、本发明的再一目的是提供：一种猪传染性胸膜肺炎二价灭活omv疫苗的制备方法，按照下述重量份数称取各原料，并进行制备：

16、(1)油相制备：取注射用白油94份，先加入6份司本-80，然后边搅拌边加入硬脂酸铝2份，加热搅拌至透明，高温高压灭菌，制备得到油相备用；

17、(2)水相制备：根据活菌计数和外膜囊泡的bca含量检测结果，根据需求，将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型gz株灭活菌液、7型zq株灭活菌液和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌omvs组合物按不同比例混合，配制成含外膜囊泡的混合菌液取混合菌液96份，4份灭菌吐温-80，充分混匀，制备得到水相，备用；

18、(3)乳化：取油相2份低速搅拌的同时，缓缓加水相1份，以4000rpm搅拌30min乳化成油乳剂，在终止搅拌前加入1％的硫柳汞溶液，使其在疫苗中的终浓度不超过0.01％，即制得猪传染性胸膜肺炎二价灭活omv疫苗。

19、优选的，步骤(2)所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型gz株菌液和7型zq株灭活菌液的浓度均≥3.2×109cfu/ml，两菌液等量混合，组合物中两种omvs含量均≥78.125μg/ml。

20、优选的，所述猪传染性胸膜肺炎二价灭活omv疫苗中猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1型gz株和7型zq株外膜囊泡的浓度均为25μg/ml。

21、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

22、(1)通过动物试验证明本发明猪传染性胸膜肺炎二价灭活omv疫苗具有显著预防猪传染性胸膜肺炎病的效果；

23、(2)制得猪传染性胸膜肺炎二价灭活omv疫苗在降低胸膜肺炎放线杆菌1型gz株和7型zq株的灭活菌体含量的情况下，仍具有显著预防猪传染性胸膜肺炎病的效果；

24、(3)本发明使用中空纤维浓缩系统对样品进行浓缩，可实现大量提取外膜囊泡，同时使用peg浓缩代替两次超速离心，即低了成本又降低了操作难度，使外膜囊泡的大量提取及产业化成为可能。