腺相关病毒(AAV)进化枝F载体及其用途

背景技术：

1、腺病毒相关病毒(aav)是细小病毒科(parvovirus)的成员，是一种小的无包膜二十面体病毒，具有约4.7千碱基(kb)长的单链线性dna(ssdna)基因组。野生型基因组包含在dna链两端的反向末端重复(itr)和两个开放阅读框(orf)：rep和cap。rep由编码aav生命周期所需的rep蛋白的四个重叠基因组成，并且cap包含衣壳蛋白vp1、vp2和vp3的重叠核苷酸序列，vp1、vp2和vp3自组装形成二十面体对称的衣壳。

2、aav被分配到依赖性病毒(dependovirus)属，因为该病毒被发现是纯化的腺病毒原种中的污染物。aav的生命周期包括潜伏期，在此阶段aav基因组在感染后特异性整合到宿主染色体中，以及感染期，在此阶段在腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，整合的基因组随后被拯救、复制并包装成感染性病毒。非致病性、感染性的广泛宿主范围(包括非分裂细胞)、和潜在的位点特异性染色体整合的特性使aav成为基因转移的有吸引力的工具。

3、已经将来自复制缺陷型人细小病毒的重组腺相关病毒(raav)载体描述为用于基因递送的合适载体。通常，从载体中除去功能性rep基因和cap基因，产生无复制能力的载体。这些功能在载体生产系统中提供，但在最终载体中不存在。

4、迄今为止，已经有从人或非人灵长类动物(nhp)分离的多种不同的充分表征的aav。已经发现，不同血清型的aav表现出不同的转染效率，并且表现出对不同细胞或组织的向性。wo 2005/033321中描述了许多不同的aav进化枝，包括进化枝f，其在其中被鉴定为仅具有三个成员aav9、aavhu31和aavhu32。aav9的结构分析在m.a.dimattia等人,j.virol.(2012年6月)vol.86no.126947-6958中。该文献报道了aav9具有三种可变蛋白(vp)的60个拷贝(总共)，所述可变蛋白(vp)由cap基因编码并具有重叠序列。这些包括vp1(87kda)、vp2(73kda)和vp3(62kda)，它们分别以1:1:10的预测比率存在。vp3的整个序列在vp2内，并且vp2整个在vp1内。vp1具有独特的n末端结构域。精细坐标(refined coordinate)和结构因素可在rcsb pdb数据库的登录号3ux1下获得。

5、已经设计了多种不同的aav9变体以去靶向(detarget)或靶向不同的组织。参见，例如，n.pulicheria,"engineering liver-detargetedaav9vectors for cardiac andmusculoskeletal gene transfer",molecular therapy,vol,19,no.6,p.1070-1078(2011年6月)。还报道了递送基因穿过血脑屏障的aav9变体的开发。参见例如b.e.deverman等人,nature biotech,vol.34,no.2,p 204-211(2016年2月1日在线发布)和caltech pressrelease,a.wetherston,www.neurology-central.com/2016/02/10/successful-delivery-of-genes-thr ough-the-blood-brain-barrier/,accessed 10/05/2016。还参见wo 2016/0492301和us 8,734,809。

6、期望的是用于递送异源分子的基于aav的构建体。

技术实现思路

1、描述了新的aavhu68衣壳和rep序列，其用于制备和用于将核酸分子递送至宿主细胞的载体。在某些实施方案中，提供了具有aavhu68衣壳的重组aav，所述aavhu68衣壳由seqid no:1的核酸序列或与编码seq id no:2的氨基酸序列的seq id no:1具有至少70％同一性，与seq id no:1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％同一性的核酸序列编码。

2、在一个实施方案中，提供了重组腺相关病毒(raav)，其包含：(a)aav68衣壳，所述aav68衣壳包含以下的一种或多种：(1)aav hu68衣壳蛋白，其包含：自由编码seq id no:2的1至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的aavhu68 vp1蛋白，由seq id no:1产生的vp1蛋白，或者由与编码seq id no:2的1至736的预测氨基酸序列的seq id no:1具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp1蛋白，由编码seq id no:2的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的aavhu68 vp2蛋白，由包含seq id no:1的至少核苷酸412至2211的序列产生的vp2蛋白，或者由与编码seq id no:2的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列的seq id no:1的至少核苷酸412至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp2蛋白，由编码seq id no:2的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的核酸序列表达所产生的aavhu68 vp3蛋白，由包含seq id no:1的至少核苷酸607至2211的序列产生的vp3蛋白，或者由与编码seq id no:2的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列的seq id no:1的至少核苷酸607至2211具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp3蛋白；和/或(2)aav衣壳蛋白，其包含：基于seq id no:2的vp1衣壳的编号，任选地包含位置157处的缬氨酸和/或位置67处的谷氨酸的vp1蛋白的异质群、任选地包含位置157处的缬氨酸的vp2蛋白的异质群、和vp3蛋白的异质群，其中至少vp1和vp2亚群包含位置157处的缬氨酸，并且任选地还包含位置67处的谷氨酸；和/或(3)为编码seq id no:2的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp1蛋白的异质群，为编码seq id no:2的至少约氨基酸138至736的氨基酸序列的核酸序列的产物的vp2蛋白的异质群，和为编码seq id no:2的至少氨基酸203至736的氨基酸的核酸序列的产物的vp3蛋白的异质群，其中：vp1、vp2和vp3蛋白包含具有氨基酸修饰的亚群，该亚群包含seq id no:2的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少两个高度脱酰胺的天冬酰胺(n)，并且任选地还包含含有其他脱酰胺氨基酸的亚群，其中所述脱酰胺导致氨基酸改变；以及(b)所述aavhu68衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包含核酸分子，所述核酸分子包含aav反向末端重复序列和编码产物的非aav核酸序列，所述非aav核酸序列与指导产物在宿主细胞中表达的序列可操作地连接。例如，四个残基(n57、n329、n452、n512)通常显示高水平的脱酰胺。其他残基(n94、n253、n270、n304、n409、n477和q599)在不同批次之间也显示多至～20％的脱酰胺水平。

3、在某些实施方案中，脱酰胺的天冬酰胺被脱酰胺为天冬氨酸、异天冬氨酸、互变天冬氨酸/异天冬氨酸对、或其组合。在某些实施方案中，脱酰胺的谷氨酰胺被脱酰胺为(α)-谷氨酸、γ-谷氨酸、互变(α)-谷氨酸/γ-谷氨酸对、或其组合。

4、在某些实施方案中，aavhu68衣壳包含具有以下的一种或多种的亚群：(a)基于seqid no:2的编号，位于vp1蛋白位置57处的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少65％的天冬酰胺(n)被脱酰胺；(b)基于seq id no:2的氨基酸序列的残基编号，vp1、v2和vp3蛋白位置329的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少75％的n被脱酰胺；(c)基于seq id no:2的氨基酸序列的残基编号，vp1、v2和vp3蛋白位置452的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少50％的n被脱酰胺；和/或(d)基于seq id no:2的氨基酸序列的残基编号，vp1、v2和vp3蛋白位置512的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少75％的n被脱酰胺。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1的亚群，其中如使用质谱法测定的，vp1蛋白的位置57处的75％至100％的n被脱酰胺。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中如使用质谱法测定的，基于seq id no:2的编号，位置329处的75％至100％的n被脱酰胺。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中如使用质谱法测定的，基于seq id no:2的编号，位置452处的75％至100％的n被脱酰胺。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1蛋白、vp2蛋白和/或vp3蛋白的亚群，其中基于seq id no:2的编号，位置512处的75％至100％的n被脱酰胺。在某些实施方案中，编码蛋白质的核酸序列是seq id no:1，或与编码seq id no:2的氨基酸序列的seq id no:1具有至少80％至至少99％同一性的序列。在某些实施方案中，该序列与seq id no:1具有至少80％至97％同一性。在某些实施方案中，raavhu68衣壳还至少包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的亚群，该亚群具有从seq id no:2的氨基酸的修饰，其在选自以下的至少四个位置处包含至少约50％至100％的被脱酰胺：n57、329、452、512的一个或多个，或其组合。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的亚群，该亚群还在以下的至少一个或多个位置处包含1％至约40％的脱酰胺：n94、n113、n252、n253、q259、n270、n303、n304、n305、n319、n328、n336、n409、n410、n477、n515、n598、q599、n628、n651、n663、n709，或其组合。在某些实施方案中，hu68衣壳包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的亚群，该亚群还包含一个或多个修饰，该修饰选自以下的一种或多种中的一个或多个修饰：乙酰化赖氨酸、磷酸化丝氨酸和/或苏氨酸、异构化天冬氨酸、氧化色氨酸和/或甲硫氨酸、或酰胺化氨基酸。在某些实施方案中，raavhu68包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1至1.5个vp2比3至10个vp3蛋白。在某些实施方案中，aavhu68包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1个vp2比3至9个vp3蛋白。在某些实施方案中，载体基因组包含来自除aavhu68以外的aav来源的aav itr序列。

5、在某些实施方案中，提供了一种组合物，其包含重组腺相关病毒hu68(raavhu68)的混合群，其中每个raavhu68独立地选自如本文所述的raavhu68。在某些实施方案中，平均aavhu68衣壳包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1至1.5个vp2比3至10个vp3蛋白。在某些实施方案中，平均aavhu68衣壳包含约60个总衣壳蛋白，其比率为约1个vp1比约1个vp2比3至6个vp3蛋白。在某些实施方案中，组合物被配制用于鞘内递送，并且载体基因组包含编码用于递送至中枢神经系统的产物的核酸序列。在某些实施方案中，组合物被配制用于静脉内递送。在某些实施方案中，载体基因组包含编码抗her2抗体的核酸序列。在某些实施方案中，组合物被配制用于静脉内递送。在某些实施方案中，组合物被配制用于鼻内或肌肉内递送。在某些实施方案中，组合物包含至少raavhu68载体原液和任选的载剂、赋形剂和/或防腐剂。

6、在某些实施方案中，提供了如本文所述的raavhu68或组合物用于将期望的基因产物递送至有需要的受试者的用途。

7、在某些实施方案中，提供了用于产生重组aavhu68的raav生产系统。生产系统包括：(a)编码seq id no:2的氨基酸序列的aavhu68衣壳核酸序列；(b)适于包装到aavhu68衣壳中的核酸分子，所述核酸分子包含至少一个aav反向末端重复(itr)和编码基因产物的非aav核酸序列，所述非aav核酸序列与指导产物在宿主细胞中表达的序列可操作地连接；以及(c)足够的aavrep功能和辅助功能，以允许将核酸分子包装到重组aavhu68衣壳中。在某些实施方案中，(a)的核酸序列至少包含seq id no:1，或与编码seq id no:2的氨基酸序列的seq id no:1具有至少70％至至少99％同一性的序列。在某些实施方案中，该系统任选地还包含编码seq id no:2的约aa203至约氨基酸736的aavhu68 vp3的seq id no:1的约nt607至约nt2211的核酸序列。在某些实施方案中。该系统包含人胚胎肾293细胞或杆状病毒系统。

8、在某些实施方案中，提供了用于降低aavhu68衣壳的脱酰胺的方法。该方法包括从含有修饰的aavhu68 vp密码子的核酸序列产生aavhu68衣壳，该核酸序列独立地包含位于seq id no:2中的位置58、330、453和/或513处的一至三个精氨酸-甘氨酸对处的修饰的甘氨酸密码子，使得修饰的密码子编码除甘氨酸以外的氨基酸。在某些实施方案中，该方法包括从含有修饰的aavhu68vp密码子的核酸序列产生aavhu68衣壳，该核酸序列独立地包含位于seq id no:2中的位置57、329、452和/或512处的一至三个精氨酸-甘氨酸对处的修饰的精氨酸密码子，使得修饰的密码子编码除精氨酸以外的氨基酸。在某些实施方案中，每个修饰的密码子编码不同的氨基酸。在某些实施方案中，两个或更多个修饰的密码子编码相同的氨基酸。在某些实施方案中，如本文所述的突变aavhu68衣壳包含精氨酸-甘氨酸对中的突变，使得甘氨酸变为丙氨酸或丝氨酸。突变aavhu68衣壳可包含一个、两个或三个突变体，其中参考aavhu68天然地含有四个ng对。在某些实施方案中，突变aavhu68衣壳包含ng对中的仅单个突变。在某些实施方案中，突变aav衣壳包含在两个不同ng对中的突变。在某些实施方案中，突变aavhu68衣壳包含位于aavhu68衣壳中的结构上分开的位置的两个不同的ng对中的突变。在某些实施方案中，突变不在vp1独特区域中。在某些实施方案中，突变之一在vp1独特区域中。任选地，突变aavhu6衣壳不含ng对中的修饰，但包含突变以最小化或消除位于ng对外的一个或多个天冬酰胺或谷氨酰胺中的脱酰胺作用。

9、在某些实施方案中，提供了突变raavhu68，其包含与未修饰的aavhu68衣壳相比具有降低的脱酰胺的经修饰的raavhu68衣壳，所述突变raavhu68使用本文所述的方法产生。

10、在另一方面，提供了用于提高重组腺相关(raav)载体的产量和/或包装效率的方法。该方法包括工程化aav衣壳基因以表达具有在氨基酸位置157处的val的vp1蛋白，其中氨基酸残基的编号基于aavhu68的全长vp1[seq id no:2]。在某些实施方案中，提供了进化枝f raav，其基于seq id no:2的编号在氨基酸位置67处具有谷氨酸(glu或e)。

11、在另一个实施方案中，提供了根据该方法产生的工程化raav。

12、在另一个实施方案中，提供了表达用于治疗和/或预防her2+癌症的抗her2抗体的aavhu68颗粒。

13、在另一个实施方案中，提供了核酸分子，其包含在外源调节控制序列的控制下编码aavhu68 rep蛋白或其功能片段的核酸序列，所述外源调节控制序列指导其在宿主细胞中的表达。在一个实施方案中，rep蛋白具有seq id no:4的氨基酸序列或其功能片段。

14、从以下对本发明的详细描述中，本发明的这些和其他方面将是显而易见的。