新型透明质酸水解酶突变体和包含其的药物组合物的制作方法

本发明涉及新型人透明质酸酶变体，与作为水解透明质酸的酶的人透明质酸酶相比，所述新型人透明质酸酶变体具有增加的酶活性和热稳定性；并且更特别地涉及透明质酸酶ph20变体或其片段，所述透明质酸酶ph20变体或其片段在对应于具有seq id no:1的氨基酸序列的野生型ph20、优选由氨基酸残基l36至s490组成的成熟野生型ph20中的α螺旋区域和/或其接头区域的区域中包含一个或多个氨基酸残基取代，并且在所述透明质酸酶ph20变体或其片段中，选择性地缺失n末端或c末端氨基酸残基中的一个或多个；产生所述透明质酸酶ph20变体或其片段的方法；以及包含所述透明质酸酶ph20变体或其片段的药物组合物。

背景技术：

1、人皮肤由表皮、真皮和皮下脂肪层构成，并且皮肤中存在六种类型的糖胺聚糖。这些糖胺聚糖包括透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸角蛋白。

2、这些糖胺聚糖由重复的二糖糖单元构成。在糖胺聚糖中，二糖糖单元的数目不同，而范围从几百到几千。在糖胺聚糖中，透明质酸在皮肤中的存在超过在人体中的量的一半。透明质酸是由存在于细胞膜中的透明质酸合酶合成的，其单独存在而不与蛋白聚糖结合，并且是唯一不具有硫酸基团的糖胺聚糖。其他糖胺聚糖与蛋白聚糖结合并且具有硫酸基团。透明质酸由通过交替的β-1,4和β-1,3键连接的葡萄糖醛酸和n-乙酰葡糖胺组成，并且由这些二糖的约5,000个重复单元构成。已知每天人体中约三分之一(5g)的透明质酸被转换(turn over)。

3、透明质酸酶是降解存在于细胞外基质中的透明质酸的酶。已知人体中存在六种类型的透明质酸酶：它们是hyal1、hyal2、hyal3、hyal4、hyalps1和ph20/spam1。人hyal1和hyal2在大多数组织中表达。ph20/spam1(以下称为ph20)在精子质膜和顶体膜中表达。然而，hyalps1不表达，因为其是假基因。根据切割透明质酸的方法，透明质酸酶分为三种类型：通过使用h2o切割n-乙酰葡糖胺与葡萄糖醛酸之间的β-1,4键的酶(ec 3.2.1.35)；通过使用h2o切割n-乙酰葡糖胺与葡萄糖醛酸之间的β-1,3键的酶(ec 3.2.1.36)；以及在不使用h2o的情况下切割β-1,4键的细菌透明质酸酶(ec 4.2.99.1)。

4、hyal1的催化氨基酸是d129和e131，它们通过底物辅助催化来水解透明质酸。hyal1在3至4的酸性ph下展现出最佳活性，而在4.5或更高的ph下没有酶活性。与hyal1形成对照，ph20在3至8的宽ph范围内展现出酶活性。

5、arming等人鉴定ph20的催化氨基酸为d111和e113(arming等人,1997)。arming等人将leu标记为成熟蛋白的第一个氨基酸，并且因此带有信号肽的全长ph20的催化氨基酸分别对应于d146和e148。

6、透明质酸酶水解透明质酸，从而降低透明质酸在细胞外基质中的粘度并增加其向组织(皮肤)的渗透性。皮肤的皮下区域具有约7.0至7.5的中性ph。因此，在各种类型的透明质酸酶中，ph20在临床实践中被广泛使用(bookbinder等人,2006)。在其中ph20用于临床实践的例子中，ph20在眼科手术中用作眼松弛剂和麻醉添加剂，并且还与皮下注射的抗体治疗剂共同给予(bookbinder等人,2006)。此外，基于透明质酸在肿瘤细胞中过表达的特性，ph20用于水解肿瘤细胞的细胞外基质中的透明质酸，从而增加抗癌治疗剂对肿瘤细胞的接近。此外，其还用于促进组织中过量存在的体液和血液的再吸收。

7、ph20由lathrop等人首先在豚鼠精子中鉴定，并且还已知在不同物种的精子中表达。人ph20基因由lin等人和gmachl等人克隆。人ph20具有seq id no:1的氨基酸序列，其由509个氨基酸残基组成，并且与豚鼠ph20基因展现出60％的氨基酸同一性。人ph20酶由spam1(精子粘附分子-1)基因编码，并且ph20的ser490以与精子质膜表面上和顶体膜中的糖基磷脂酰肌醇(gpi)结合的形式存在。当精子穿过卵母细胞富含透明质酸的卵丘层渗透卵母细胞时，其使用ph20水解透明质酸。精子中ph20以相当于蛋白质量的1％或更少的量存在，并且具有六个n-糖基化位点(n82、n166、n235、n254、n368和n393)。

8、目前可商购的ph20是通过从牛或绵羊的睾丸中提取获得的。其例子包括(牛透明质酸酶)和(绵羊透明质酸酶)。

9、牛睾丸透明质酸酶(bth)是通过在翻译后修饰过程中从牛野生型ph20移除信号肽和c末端上的56个氨基酸而获得的。bth也是一种糖蛋白，并且基于包括氨基酸的总组分，其甘露糖含量为5％且葡萄糖胺含量为2.2％。当将动物来源的透明质酸酶以高剂量重复给予至人体时，可以产生中和抗体。由于动物来源的透明质酸酶除ph20之外还含有其他生物材料，因此其在给予至人体时可能引起过敏反应(bookbinder等人,2006)。特别地，由于担心疯牛病，从牛提取的ph20的生产和使用可能受到限制。为了克服此问题，已对人ph20的重组蛋白进行了研究。

10、据报道，人ph20的重组蛋白在酵母(毕赤酵母(p.pastoris))、ds-2昆虫细胞和动物细胞中表达。在昆虫细胞和酵母中产生的重组ph20蛋白在翻译后修饰过程中的n-糖基化模式方面与人ph20不同。

11、在透明质酸酶中，仅确定了hyal1(pdb id:2pe4)(chao等人,2007)和蜂毒透明质酸酶(pdb id:1fcq、1fcu、1fcv)的三维结构。hyal1由两个结构域构成，一个催化结构域和一个egf样结构域。催化结构域呈(β/α)8形式，其中表征蛋白质二级结构的α螺旋和β链各自重复八次(chao等人,2007)。egf样结构域在变体中是完全保守的，在所述变体中hyal1的c末端被不同地拼接。hyal1和ph20的氨基酸序列是35.1％相同的，并且尚未发现ph20的蛋白质结构。

12、一种人ph20的重组蛋白是由halozyme therapeutic,inc.开发的，并以商品名出售(bookbinder等人,2006；frost,2007)。

13、当ph20的催化氨基酸d146和e148分别突变为天冬酰胺(d146n)和谷氨酰胺(e148q)时，不存在酶活性(arming等人,1997)。此外，当ph20的r246被甘氨酸取代时，酶活性降低了90％，并且当e319被谷氨酰胺取代并且r322被苏氨酸取代时，酶活性消失。与野生型ph20相比，其中在ph20的c末端处移除了36个氨基酸(474-509氨基酸截短)的变体显示酶活性降低了75％。此变体不分泌到细胞外，而是保留在hela细胞中。当从ph20移除c末端134个氨基酸时，ph20没有酶活性，也不分泌到细胞外。根据frost等人，ph20的c末端477-483区域对于可溶性表达是必不可少的(frost,2007)。全长ph20(1至509)或在位置467处c末端被截短的ph20变体的活性仅为在位置477至483中的一处c末端被截短的ph20变体的10％(frost,2007)。

14、同时，重组ph20在重组细胞中仍没有足够的热稳定性或表达水平。因此，工业上对具有进一步改善的生物学和物理化学特征的重组透明质酸酶有很大的需求。

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明的一个目的是提供一种透明质酸酶ph20变体或其片段，与野生型ph20、优选成熟野生型ph20相比，所述透明质酸酶ph20变体或其片段的热稳定性、酶活性和表达水平得到改善。

3、本发明的另一个目的是提供一种用于治疗癌症的组合物，所述组合物包含上述透明质酸酶ph20变体或其片段；以及使用所述组合物治疗癌症的方法。

4、技术方案

5、为了实现以上目的，本发明提供了透明质酸酶ph20变体或其片段，所述透明质酸酶ph20变体或其片段在对应于野生型ph20、优选成熟野生型ph20的氨基酸序列中的α螺旋区域和/或其接头区域的区域中包含一个或多个氨基酸残基取代，并且在所述透明质酸酶ph20变体或其片段中，选择性地缺失n末端或c末端氨基酸残基中的一个或多个。

6、本发明还提供了用于治疗癌症的组合物，所述组合物包含上述透明质酸酶ph20变体或其片段；以及使用所述组合物治疗癌症的方法。