一种基于PCR的多色荧光通道检测方法及应用与流程

文档序号:39898025发布日期:2024-11-05 16:59阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种基于pcr的多色荧光通道检测方法,其特征在于,包括以下步骤:

2.根据权利要求1所述的一种基于pcr的多色荧光通道检测方法,其特征在于:步骤s2中所述的荧光探针有两条,每条荧光探针均在5’端的+7位掺杂lna碱基,+14位掺杂rna碱基;5’端的+3~+7位以及+15~+18位序列互补;且所述荧光探针的两端分别偶联荧光基团和淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的一种基于pcr的多色荧光通道检测方法,其特征在于:两条所述荧光探针的核苷酸序列分别如seq id no.1及seq id no.2所示。

4.根据权利要求3所述的一种基于pcr的多色荧光通道检测方法,其特征在于:步骤s2中所述的特异性引物为特异性长引物或者工作浓度比为1:3的特异性长引物与特异性短引物混合液。

5.根据权利要求4所述的一种基于pcr的多色荧光通道检测方法,其特征在于:所述特异性长引物是在特异性引物5’端引入与荧光探针序列相同的tag,并在tag和特异性引物序列间插入碱基bridge序列,bridge序列与荧光探针中5’末端的悬挂碱基ac互补;

6.根据权利要求5所述的一种基于pcr的多色荧光通道检测方法,其特征在于:步骤s2中同步双酶pcr的反应程序为:热启动94℃5min,解旋94℃30s,退火加酶切61℃~63℃1min,扩增35个循环,最后63~65℃终延伸兼终酶切10min。

7.一种pcr反应用荧光探针,其特征在于:所述荧光探针掺杂有lna碱基和rna碱基,且所述荧光探针的两端分别偶联荧光基团和淬灭基团。

8.一种pcr反应体系,其特征在于:包括dna模板5-50ng,特异性引物400-800nm,通用反向引物400-800nm,荧光探针100-200nm,rnase hii酶25-50mu,pcrmix 1×,其它体积用水补足。

9.一种包含权利要求8所述的pcr反应体系的产品。

10.根据权利要求9所述的产品,其特征在于,所述产品包括试剂盒。


技术总结
本发明公开了一种基于PCR的多色荧光通道检测方法及应用,属于基因检测技术领域。该方法通过在PCR反应体系中添加热稳定的RNase HII核糖核酸内切酶及掺杂了RNA碱基和LNA碱基的荧光探针,该荧光探针可以兼容多色荧光通道;同时,PCR反应体系中的特异性引物在5’端引入与荧光探针序列相同的TAG,并在TAG和特异性引物序列间插入碱基bridge序列,形成特异性长引物,特异性长引物与特异性短引物的结合能够使荧光探针可以在不需要和特异性引物延伸链竞争的前提下和互补链结合,提高荧光探针的退火效率。本发明利用RNase HII核糖核酸内切酶对探针进行酶切,使探针两端偶联的荧光基团和淬灭基团彻底远离,发出强荧光信号,具有成本低、特异性高、多色通道、信号强的优点。

技术研发人员:赵锦祥
受保护的技术使用者:赵锦祥
技术研发日:
技术公布日:2024/11/4
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