一种设计多肽药物的方法及应用

本发明属于生物医药领域，涉及一种设计多肽药物的方法及应用。

背景技术：

1、多肽药物是指通过化学合成、基因重组或动植物中提取的具有特定治疗作用的由氨基酸通过肽键连接而成的一类化合物，多肽具有广泛的生物活性，能够参与和调控众多生理和病理过程。近年来，随着生物技术的快速发展，多肽药物已成为药物研发领域的热点之一，越来越多的多肽药物被开发并且已广泛应用于肿瘤、肝炎、糖尿病、艾滋病等疾病的预防、诊断和治疗。多肽药物的研究与应用，对于创新药物开发、提高疾病治疗效果、降低药物副作用等方面具有重要意义。

2、多肽药物的分子大小介于小分子药物和大分子蛋白质药物之间，相对于小分子药物，多肽药物具有更高的活性和更强的选择性；相对于蛋白质药物，多肽药物具有免疫原性低、纯度高、生产成本较低等优势。然而，多肽的氨基酸数量相比蛋白质来说较少，在机体内很容易被蛋白酶降解，尤其是在多肽主链上容易发生脱酰胺反应会造成侧链上氨基酸残基的构象发生改变，例如α-螺旋(α-helix)、β-折叠(β-sheet)结构发生裂解和二硫键、氢键的断裂等。这些因素使得大部分多肽类药物在体内的稳定性差、生物利用度低，因此，对多肽药物结构进行改造或修饰，改善其理化性质，从而提高药物稳定性和生物活性，是多肽药物研发的重点之一。

3、因此，本领域仍然需要坚持不懈地研发稳定、高效的多肽药物，以满足临床需求。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中由于多肽主链上容易发生脱酰胺反应造成的多肽药物稳定性差、活性低的问题，本发明提供了一种设计多肽药物的方法及应用。

2、本发明提供一种多肽化合物，包括多肽和连接在多肽c末端和/或n末端的具有α-螺旋结构的“eaaakk”序列。

3、本发明创造性地将具有α-螺旋结构的“eaaakk”序列连接在多肽的c末端和/或n末端，赋予多肽显著增加的α-螺旋结构、热稳定性和生物活性。

4、本发明所述多肽化合物的一个或多个氨基酸可以用构象为d-型的氨基酸、人工修饰的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸等进行替换，以提高多肽的生物利用度、稳定性和/或生物活性。其中d-型氨基酸是指与组成蛋白质的l型氨基酸相对应的氨基酸；人工修饰的氨基酸指经过甲基化、磷酸化等修饰的组成蛋白质的常见l型氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括组成蛋白质的不常见氨基酸和不组成蛋白质的氨基酸，例如5-羟基赖氨酸、甲基组氨酸、x氨基丁酸、高丝氨酸等。

5、所述多肽化合物包括不同的光学异构体、消旋体和/或它们的混合物。上述情况下，其中单一的对映异构体或非对映异构体，如有旋光的异构体，可以用不对称合成的方法或消旋体拆分的方法获得。消旋体的拆分可用不同的方法实现，如常规的用助拆分的试剂重结晶，或用色谱方法。

6、所述多肽化合物包括不同的带双键的顺式和/或反式的异构体。

7、多肽化合物的衍生物可为化合物的溶剂化物、化合物的络合物、化合物的螯合物或化合物的非共价复合物。化合物的衍生物还可为该化合物基础上的药物前体。

8、在制备药物时，可采用以上多肽化合物的任意形式的混合物。

9、在制备的药物中，可含有以上多肽化合物的任意形式的混合物。

10、进一步地，所述多肽化合物为具有式i的化合物，所述式i为：x1-x2-xn-x3-x4；在式i中，所述x1为氨基端保护基团；所述xn为任一多肽序列；所述x4为羧基端保护基团；所述x2为“eaaakk”序列或为不存在，所述x3为“eaaakk”序列或为不存在，且所述x2和所述x3中至少一个为“eaaakk”序列。

11、示例性的，所述x1为乙酰基(ac)、氨基(nh2)、马来酰基、琥珀酰基、叔丁氧羰基或苄氧和其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团。

12、示例性的，所述xn为“svvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyik”多肽序列或“vdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyik”多肽序列或其他任一多肽序列；

13、示例性的，所述x4为为氨基(nh2)、羧基、羟基、酰胺基或叔丁氧羰基或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团。

14、示例性的，所述多肽化合物为多肽p43；多肽p43为式i所示化合物，x1为ac，x2为不存在，xn为“svvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyik”多肽序列，x3为“eaaakk”序列，x4为nh2。

15、示例性的，所述多肽化合物为多肽p54；多肽p54为式i所示化合物，x1为ac，x2为不存在，xn为“vdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyik”多肽序列；x3为“eaaakk”序列，x4为nh2。

16、在抗新型冠状病毒多肽p37和p48的c末端加上“eaaakk”序列所得到的多肽p43和p54能够显著提高多肽的抗病毒活性和多肽的α-螺旋含量及其热稳定性，同时多肽与靶序列结合的能力也得到明显提高。

17、本发明还保护所述多肽化合物的氨基端和/或羧基端进行亲脂性化合物修饰得到的衍生物；或为所述多肽化合物在药学上可用的不同形式。

18、其中，所述亲脂性化合物包括胆固醇琥珀酸单酯、2-胆固醇乙酸、2-胆固醇丙酸、3-胆固醇丙酸、2-胆固醇丁酸、2-胆固醇异丁酸、3-胆固醇丁酸、3-胆固醇异丁酸、4-胆固醇丁酸、2-胆固醇戊酸、2-胆固醇异戊酸、3-胆固醇戊酸、5-胆固醇戊酸、2-胆固醇己酸、6-胆固醇己酸、2-胆固醇庚酸、7-胆固醇庚酸、2-胆固醇辛酸、8-胆固醇辛酸、溴乙酸胆固醇酯、含8到20个碳原子的脂肪酸(如十八烷酸)、二氢(神经)鞘氨醇、维生素e等脂类化合物。

19、其中，所述多肽的药学上可用的不同形式包括各种可药用的盐、溶剂化物、络合物、螯合物、非共价的复合物、基于上述物质基础上的药物前体和上述这些形式的任意混合物。

20、本发明还保护由以上任一所述多肽化合物和/或其药用盐和/或其衍生物形成的多聚体；或以上任一所述多肽化合物和/或其药用盐和/或其衍生物的融合蛋白。

21、本发明还保护具有生物活性的药用化合物，为以上任一所述多肽化合物或其药用盐或其衍生物或者以上任一所述多聚体或融合蛋白。

22、所述药用化合物的用途为治疗和/或预防相应疾病。

23、本发明所述疾病包括但不限于肿瘤、肝炎、糖尿病、艾滋病、冠状病毒感染所致疾病等。

24、采用本发明的方法制备的改造后的多肽药物，具有显著增加的-螺旋结构、热稳定性和/生物活性。

25、本发明还保护以上任一所述多肽或其药用盐或其衍生物在制备治疗和/或预防相应疾病的药物中的应用。

26、本发明还保护“eaaakk”序列在制备增强多肽药物的α-螺旋结构、热稳定性和生物活性的化合物中的应用。

27、本发明还提供一种核酸分子，其编码所述的多肽化合物。

28、进一步地，所述核酸分子可以是dna(如cdna、基因组dna或重组dna等)或rna(如mrna或hnrna等)。

29、本发明还保护增强多肽药物的α-螺旋结构和/或热稳定性和/或生物活性的方法，包括如下步骤：将“eaaakk”序列连接至多肽的n末端和/或c末端。

30、本发明提供了一种设计多肽药物的方法，包括以下步骤：

31、将具有α-螺旋结构的“eaaakk”序列连接在多肽c末端和/或n末端。

32、采用此方法或策略所制备的多肽药物具有显著增加的α-螺旋结构、热稳定性和/生物活性。

33、本发明所涉及到的更多内容在以下有详细描述，或者有些也可以在本发明的实施例中体现。除非另有所指，本文中所用来表示不同成分的数量、反应条件，在任意情况下都可解读为“大致的”、“大约的”意思。相应的，除有明确的特指外，在下述以及权利要求中所引用的数字参数都是大致的参数，在各自的实验条件下由于标准误差的不同，有可能会得到不同的数字参数。

34、本文中，当一个化合物(包括多肽化合物)的化学结构式和化学名称有分歧或疑义时，以化学结构式确切定义此化合物。本文所描述的化合物有可能含有一个或多个手性中心，和/或者双键以及诸如此类的结构，也可能存在立体异构体，包括双键的异构体(比如几何异构体)、旋光对映异构体或者非对映异构体。相应的，在本文描述范围内的任意化学结构，无论是部分或整体结构中含有上述类似结构，都包括了此化合物的所有可能的对映异构体和非对映异构体，其中也包括了单纯的任一种立体异构体(如单纯的几何异构体、单纯的对映异构体或者单纯的非对映异构体)以及这些异构体的任意一种混合物。这些消旋异构体和立体异构体的混合物由本领域技术人员利用手性分离技术或手性分子合成的方法也可进一步被拆分成其组成成分的对映异构体或立体异构体。

35、在实际应用中，可以将本发明的药物直接给予病人、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予病人，以达到治疗和/或预防疾病的目的。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药等。

36、本发明的药物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体活性成分，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。

37、本发明的药物可以直接单独用于疾病的治疗和预防，也可以与一种或多种其他抗病毒药物联合使用，以达到提高整体治疗效果的目的。

38、对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体活性成分的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体活性成分的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体活性成分组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，活性成分的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

39、有益效果：

40、本发明创造性地将具有α-螺旋结构的“eaaakk”序列连接在抗新型冠状病毒多肽的c末端和/或n末端，赋予多肽显著增加的α-螺旋结构、热稳定性和生物活性。

41、多肽p43和p54，相对于c末端不连接“eaaakk”序列的多肽，抗病毒活性提高了约20倍，同时，“eaaakk”序列的引入改变了多肽的二级结构，显著增加了多肽的α-螺旋含量和热稳定性，与靶序列结合的能力也得到明显提高。