一种芪参益气滴丸改善内皮氧化损伤的方法及应用与流程

本发明涉及医疗，具体为一种芪参益气滴丸改善内皮氧化损伤的方法及应用。

背景技术：

1、动脉粥样硬化是心脑血管事件的重要发病机制，其发生、发展与内皮细胞功能紊乱、脂质聚积和炎症进展密不可分，血管内皮细胞是覆盖于血管内膜的一种细胞群，在血管壁和血液之间起屏障作用，作为机体重要的内分泌器官，能够合成和分泌多种血管活性物质，可通过维持血管收缩因子、血管舒张因子间的平衡调控血管舒张，调节血流动力学，还具有抑制血小板黏附、聚集及血栓形成的作用，血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化发展中一个关键的早期事件，也是未来心血管事件的重要危险因素，内皮受损是动脉粥样硬化发生的始动因素，并对动脉粥样硬化的进展起着决定性的作用，保护血管内皮功能是阻断各种血管性疾病发生发展的有效途径。

2、研究显示，脂代谢异常引起的氧化应激和血管内皮功能紊乱与心血管疾病的发生密切相关，高血脂可导致血管内皮细胞损伤，血液中脂质堆积于血管壁，管腔狭窄，是动脉粥样硬化形成的重要前提，降低血脂能够有效防止冠心病及心血管突发事件的发生，脂代谢的紊乱可以导致机体氧化应激反应的发生，机体过多的活性氧(ros)无法被消除，引起机体中的低密度脂蛋白在动脉壁被ros氧化修饰形成氧化低密度脂蛋白(ox-ldl)，引起内皮损伤，导致内皮细胞屏障消失，炎症因子进入内皮下，参与斑块的形成和破裂，同时内皮细胞也可以被ox-ldl刺激变为泡沫细胞，从而导致内皮损伤加重，巨噬细胞摄入ox-ldl形成泡沫细胞，可以进一步加重内皮细胞的损伤。

3、氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxldl)能够诱导血管内皮细胞氧化应激，降低细胞抗氧化能力，引起血管内皮细胞氧化损伤，目前，通过降低氧化应激改善血管内皮细胞功能，已成为预防和治疗心血管疾病的一种策略，氧化型低密度脂蛋白(0x-ldl)可通过减少增殖、促进凋亡和引发炎症而引起内皮细胞功能障碍，降低血管内皮活性，导致病变部位形成不稳定斑块，以及斑块破裂后引发急性综合征，因此，ox-ldl作为建立细胞损伤模型的关键诱导因子在心血管药理研究中得到了广泛应用。

4、本研究采用ox-ldl诱导的人脐静脉内皮细胞损伤模型，研究芪参益气滴丸对模型细胞的存活率、ros、sod、mda及ldh水平的影响，明确芪参益气滴丸改善高脂所致的血管内皮细胞氧化损伤的作用机制。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种芪参益气滴丸改善内皮氧化损伤的方法及应用，解决了现有的治疗方法在安全性、疗效和副作用方面存在不足的问题。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种芪参益气滴丸改善内皮氧化损伤的方法，包括以下步骤：

3、s1.准备材料；将实验需要使用到的材料进行准备，有利于后续实验的进行，所述实验材料包括实验细胞、药品、培养基、主要试剂和主要仪器；

4、s2.实验步骤：进行实验，判定芪参益气滴丸的具体效果

5、s201.细胞培养：huvec细胞用10-15％胎牛血清、100-120u/ml青霉素、100-120u/ml链霉素的dmem培养，在恒温培养箱中以5-6％co2、37-38℃以及饱和湿度条件下松盖培养，每1～2d换液1次，当细胞长至90-95％铺满时传代，备用；

6、s202.分组及给药：将对数生长期的huvec细胞，1000-1500rpm离心5-10min，弃上清，用新鲜的完全培养基重悬细胞，计数3000个/孔接种于96孔细胞板中，并按照6个组别分别处理；

7、s203.指标检测：分别使用不同的检测方法对不同的指标进行检测，从而确定其功效，所述不同的指标包括有cck-8、ros；

8、s204.统计学方法：采用spss13.0统计软件，数值用mean±sd表示，采用单因素方差分析和student’s-t检验统计分析实验结果，p＜0.05有统计学差异。

9、优选的，所述步骤s1中实验细胞具体为人脐静脉内皮细胞(huvec)。

10、优选的，所述步骤s1中培养基具体为dmem高糖培养基，添加10-15％胎牛血清、100-120u/ml青霉素和100-120u/ml链霉素。

11、优选的，所述步骤s1中药品具体为芪参益气滴丸提取物。

12、优选的，所述步骤s1中主要试剂具体为cck-8试剂盒、dcfh-da、wst-1试剂、tba试剂、ldh试剂盒和pik3/akt通路抑制剂ly294002。

13、优选的，所述步骤s1中主要仪器具体为co2培养箱、离心机、酶标仪、流式细胞仪。

14、优选的，所述步骤s202中按照6个组别分别处理，其中6个组具体为：

15、空白对照组：不做任何处理；

16、模型组：用100-120μg/ml的ox-ldl处理22-24h；

17、芪参预处理组：造模之前给予芪参益气滴丸低、中、高剂量(5μm，10μm，20μm)预处理细胞10-12h；

18、pik3/akt抑制剂组(ly294002+芪参+模型)：加入20μmol/l的ly294002，30-40min，后处理同20μmol/l芪参组。

19、优选的，所述步骤s203中，cck-8的检测方法具体为：

20、cck-8：37℃、5％co2培养箱中培养24h、48h、72h后，向每孔加入100μl 10％cck-8反应液，将培养板在培养箱内孵育4-6h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

21、优选的，所述步骤s203中，ros的检测方法具体为：

22、ros：使用dcfh-da探针，流式检测胞内ros含量：按照1：1000用无血清培养液稀释dcfh-da，使终浓度为10um/l，去除细胞培养液，每孔加入1ml稀释好的dcfh-da，37℃细胞培养箱内孵育20min，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，充分去除未进入细胞内的dcfh-da，消化细胞，pbs洗两遍，流式细胞仪检测胞内ros含量。

23、一种芪参益气滴丸改善内皮氧化损伤用于改善内皮氧化损伤的情况，应用于血管疾病康复治疗的领域中。

24、本发明提供了一种芪参益气滴丸改善内皮氧化损伤的方法及应用。具备以下有益效果：

25、1、本发明使用芪参益气滴丸对含ox-ldl的人脐静脉内皮细胞模型进行处理，观察其对细胞存活率、ros(反应性氧种)、sod(超氧化物歧化酶)、mda(丙二醛)和ldh(乳酸脱氢酶)水平的影响，且实验结果表明，芪参益气滴丸能显著提高细胞存活率，减少ros和mda的生成，增加sod的活性，降低ldh的释放，从而有效改善ox-ldl诱导的血管内皮细胞氧化损伤。

26、2、本发明的芪参益气滴丸改善血管内皮细胞氧化损伤的方法，使用中药制剂，副作用小安全性高，且能有效改善血管内皮功能，减少血管病变，同时操作简单，只需要患者定期服用即可，易于在临床上广泛应用。