一种用于检测非洲猪瘟病毒P72蛋白的检测卡

本发明属于医学检测领域，涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒p72蛋白的检测卡。

背景技术：

1、非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,asfv)是非洲猪瘟病毒科(asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(asfivirus)的唯一成员，也是目前已知唯一的虫媒双链dna病毒。根据病毒血凝素cd2样蛋白(cd2v)和c型凝集素(ep153r)可将已知的asfv划分为八种血清型。基于编码asfv主要衣壳蛋白p72的b646l基因c端的478bp碱基可将其分为24个基因型。已知24个基因型的asfv在非洲均有分布。截至目前，只有基因i型和基因ii型的asfv传播至非洲以外的地区，且基因ii型asfv是当前全球流行的主要毒株。asfv是有囊膜的双链线性dna病毒，成熟的asfv粒子呈直径为260nm-300nm的球状，组成部分主要有五部分：外部包膜、病毒衣壳、内部包膜、核壳、核仁。asfv基因组由位于正二十面体衣壳内的大小为170-194kb的双股线性dna分子组成，编码151-167个开放阅读框，可表达多种蛋白。asf是一种以高致病性，高死亡率和严重出血热为特点的疾病。非洲猪瘟的爆发给养猪业带来了毁灭性的打击，造成了巨大经济损失。目前，仍无有效商业化的疫苗和药物用于防治该疾病，asf防控策略仍侧重于及早发现、限制牲畜活动以及扑杀可能感染的畜群等生物安全措施。2018年，首例非洲猪瘟在我国确诊，基因ii型强毒株成为国内主要流行株。2020年首次报道基因ⅱ型中等毒力株，局部区域流行。随后，基因ⅰ型低毒力株出现，局部区域流行。2021年首次发现基因ⅰ/ii型重组强毒株，现已成为优势流行株。多种毒株的出现使得中国非洲猪瘟疫情更加复杂，为非瘟防控带来全新挑战。

2、截至目前，国内仍无有效的商品化疫苗，因此，快速有效的诊断方法对非洲猪瘟的防控至关重要。非洲猪瘟病毒检测需要合适的样本采集、保存，以及可靠的检测方法。抗原检测可针对病毒蛋白或病毒核酸；抗体检测是针对病毒特异性抗体。当前常用的抗原检测方法为qpcr检测，可检测家猪、野猪、软蜱以及环境中的任何一种临床样本中的asfv基因组，但操作繁琐、需要昂贵的实时荧光定量pcr仪器设备和专业人员，基层应用受到严重限制；抗体检测以elisa为代表，可高通量检测猪体内asfv特异性抗体水平，但仍存在操作繁琐、需要酶标仪和恒温箱等设备，现场检测受到限制。

技术实现思路

1、随着胶体金免疫层析技术的迅速发展，其展现出巨大的检测优势，解决了实际生活中病毒检测流程复杂、时间长、高损耗的问题。本发明研发了快速检测、操作简单、价格低廉、不需要专业设备的胶体金试纸条。

2、为了解决现有技术中存在的问题，本发明第一方面提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞为第一杂交瘤细胞，第二杂交瘤细胞或者所述第一杂交瘤细胞与所述第二杂交瘤细胞的组合；

3、所述第一杂交瘤细胞为微生物保藏编号为cctcc no:c2024209的杂交瘤细胞或者微生物保藏编号为cctcc no:c2024209的杂交瘤细胞的传代细胞；所述微生物保藏编号为cctcc no:c2024209的杂交瘤细胞的传代细胞分泌的单克隆抗体保持对非洲猪瘟病毒p72蛋白的特异性结合活性；

4、所述第二杂交瘤细胞为微生物保藏编号为cctcc no:c2024214的杂交瘤细胞或者微生物保藏编号为cctcc no:c2024214的杂交瘤细胞的传代细胞；所述微生物保藏编号为cctcc no:c2024214的杂交瘤细胞的传代细胞分泌的单克隆抗体保持对非洲猪瘟病毒p72蛋白的特异性结合活性。

5、本发明第二方面提供了一种生物材料，所述生物材料是如下p1、p2、p3、p4、p5、p6、p7、p8、p9和p10中的任一种；

6、p1：单克隆抗体

7、所述单克隆抗体为第一单克隆抗体，第二单克隆抗体或者所述第一单克隆抗体与所述第二单克隆抗体的组合；

8、所述第一单克隆抗体保持对非洲猪瘟病毒p72蛋白的特异性结合活性；

9、所述第一单克隆抗体包括第一单克隆抗体重链和第一单克隆抗体轻链；

10、所述第一单克隆抗体重链包括第一单克隆抗体重链cdr1、第一单克隆抗体重链cdr2和第一单克隆抗体重链cdr3；

11、所述第一单克隆抗体轻链包括第一单克隆抗体轻链cdr1、第一单克隆抗体轻链cdr2和第一单克隆抗体轻链cdr3；

12、所述第一单克隆抗体重链cdr1蛋白序列如seq id no.3所示；

13、所述第一单克隆抗体重链cdr2蛋白序列如seq id no.5所示；

14、所述第一单克隆抗体重链cdr3蛋白序列如seq id no.7所示；

15、所述第一单克隆抗体轻链cdr1蛋白序列如seq id no.9所示；

16、所述第一单克隆抗体轻链cdr2蛋白序列如seq id no.11所示；

17、所述第一单克隆抗体轻链cdr3蛋白序列如seq id no.13所示；

18、所述第二单克隆抗体保持对非洲猪瘟病毒p72蛋白的特异性结合活性；

19、所述第二单克隆抗体包括第二单克隆抗体重链和第二单克隆抗体轻链；

20、所述第二单克隆抗体重链包括第二单克隆抗体重链cdr1、第二单克隆抗体重链cdr2和第二单克隆抗体重链cdr3；

21、所述第二单克隆抗体轻链包括第二单克隆抗体轻链cdr1、第二单克隆抗体轻链cdr2和第二单克隆抗体轻链cdr3；

22、所述第二单克隆抗体重链cdr1蛋白序列如seq id no.15所示；

23、所述第二单克隆抗体重链cdr2蛋白序列如seq id no.17所示；

24、所述第二单克隆抗体重链cdr3蛋白序列如seq id no.19所示；

25、所述第二单克隆抗体轻链cdr1蛋白序列如seq id no.21所示；

26、所述第二单克隆抗体轻链cdr2蛋白序列如seq id no.23所示；

27、所述第二单克隆抗体轻链cdr3蛋白序列如seq id no.25所示；

28、p2：单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合

29、所述单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合包括单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合1、单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合2或单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合1和单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合2的组合；

30、所述单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合1保持对非洲猪瘟病毒p72蛋白的特异性结合活性；

31、所述单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合1包括第一单克隆抗体重链和第一单克隆抗体轻链；

32、所述第一单克隆抗体重链包括第一单克隆抗体重链cdr1、第一单克隆抗体重链cdr2、第一单克隆抗体重链cdr3与功能性蛋白片段或惰性蛋白片段的氨基酸序列；

33、所述第一单克隆抗体轻链包括第一单克隆抗体轻链cdr1、第一单克隆抗体轻链cdr2、第一单克隆抗体轻链cdr3与功能性蛋白片段或惰性蛋白片段的氨基酸序列；

34、所述第一单克隆抗体重链cdr1蛋白序列如seq id no.3所示；

35、所述第一单克隆抗体重链cdr2蛋白序列如seq id no.5所示；

36、所述第一单克隆抗体重链cdr3蛋白序列如seq id no.7所示；

37、所述第一单克隆抗体轻链cdr1蛋白序列如seq id no.9所示；

38、所述第一单克隆抗体轻链cdr2蛋白序列如seq id no.11所示；

39、所述第一单克隆抗体轻链cdr3蛋白序列如seq id no.13所示；

40、所述单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合2保持对非洲猪瘟病毒p72蛋白的特异性结合活性；

41、所述单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合2包括第二单克隆抗体重链和第二单克隆抗体轻链；

42、所述第二单克隆抗体重链包括第二单克隆抗体重链cdr1、第二单克隆抗体重链cdr2、第二单克隆抗体重链cdr3与功能性蛋白片段或惰性蛋白片段的氨基酸序列；

43、所述第二单克隆抗体轻链包括第二单克隆抗体轻链cdr1、第二单克隆抗体轻链cdr2、第二单克隆抗体轻链cdr3与功能性蛋白片段或惰性蛋白片段的氨基酸序列；

44、所述第二单克隆抗体重链cdr1蛋白序列如seq id no.15所示；

45、所述第二单克隆抗体重链cdr2蛋白序列如seq id no.17所示；

46、所述第二单克隆抗体重链cdr3蛋白序列如seq id no.19所示；

47、所述第二单克隆抗体轻链cdr1蛋白序列如seq id no.21所示；

48、所述第二单克隆抗体轻链cdr2蛋白序列如seq id no.23所示；

49、所述第二单克隆抗体轻链cdr3蛋白序列如seq id no.25所示；

50、p3：抗体衍生物

51、所述抗体衍生物的形式选自：酶标抗体、荧光标记抗体、化学修饰抗体、抗体fab片段、猪源化抗体、单链抗体、嵌合单克隆抗体和改型单克隆抗体；

52、所述抗体衍生物为第一抗体衍生物，第二抗体衍生物或者所述第一抗体衍生物与所述第二抗体衍生物的组合；

53、所述第一抗体衍生物保持对非洲猪瘟病毒p72蛋白的特异性结合活性；

54、所述抗体衍生物的蛋白序列部分含有第一单克隆抗体重链cdr1、第一单克隆抗体重链cdr2、第一单克隆抗体重链cdr3、第一单克隆抗体轻链cdr1、第一单克隆抗体轻链cdr2和第一单克隆抗体轻链cdr3；

55、所述第一单克隆抗体重链cdr1蛋白序列如seq id no.3所示；

56、所述第一单克隆抗体重链cdr2蛋白序列如seq id no.5所示；

57、所述第一单克隆抗体重链cdr3蛋白序列如seq id no.7所示；

58、所述第一单克隆抗体轻链cdr1蛋白序列如seq id no.9所示；

59、所述第一单克隆抗体轻链cdr2蛋白序列如seq id no.11所示；

60、所述第一单克隆抗体轻链cdr3蛋白序列如seq id no.13所示；

61、所述第二抗体衍生物保持对非洲猪瘟病毒p72蛋白的特异性结合活性；

62、所述抗体衍生物的蛋白序列部分含有第二单克隆抗体重链cdr1、第二单克隆抗体重链cdr2、第二单克隆抗体重链cdr3、第二单克隆抗体轻链cdr1、第二单克隆抗体轻链cdr2和第二单克隆抗体轻链cdr3；

63、所述第二单克隆抗体重链cdr1蛋白序列如seq id no.15所示；

64、所述第二单克隆抗体重链cdr2蛋白序列如seq id no.17所示；

65、所述第二单克隆抗体重链cdr3蛋白序列如seq id no.19所示；

66、所述第二单克隆抗体轻链cdr1蛋白序列如seq id no.21所示；

67、所述第二单克隆抗体轻链cdr2蛋白序列如seq id no.23所示；

68、所述第二单克隆抗体轻链cdr3蛋白序列如seq id no.25所示；

69、p4：rna组合

70、所述rna组合包括第一rna组合、第二rna组合或者所述第一rna组合与所述第二rna组合的组合；

71、所述第一rna组合包括第一单克隆抗体重链rna和第一单克隆抗体轻链rna；

72、所述第一单克隆抗体重链rna能够被翻译得到p1或p2中所述的第一单克隆抗体重链；

73、所述第一单克隆抗体轻链rna能够被翻译得到p1或p2中所述的第一单克隆抗体轻链；

74、所述第二rna组合包括第二单克隆抗体重链rna和第二单克隆抗体轻链rna；

75、所述第二单克隆抗体重链rna能够被翻译得到p1或p2中所述的第二单克隆抗体重链；

76、所述第二单克隆抗体轻链rna能够被翻译得到p1或p2中所述的第二单克隆抗体轻链；

77、p5：基因组合

78、所述基因组合包括第一基因组合、第二基因组合或所述第一基因组合与所述第二基因组合的组合；

79、所述第一基因组合的编码序列能够编码p1或p2中所述的第一单克隆抗体重链以及p1或p2中所述的第一单克隆抗体轻链；

80、所述第二基因组合的编码序列能够编码p1或p2中所述的第二单克隆抗体重链以及p1或p2中所述的第二单克隆抗体轻链；

81、p6：基因表达盒组合

82、所述基因表达盒组合包括第一基因表达盒组合、第二基因表达盒组合或者所述第一基因表达盒组合与所述第二基因表达盒组合的组合；

83、所述第一基因表达盒组合中的基因表达产物为p4中所述的第一rna组合；

84、所述第二基因表达盒组合中的基因表达产物为p4中所述的第二rna组合；

85、p7：基因工程载体

86、所述基因工程载体包括第一基因工程载体、第二基因工程载体或者所述第一基因工程载体与所述第二基因工程载体的组合；

87、所述第一基因工程载体中含有p6中所述的第一基因表达盒；

88、所述第一单克隆抗体重链rna和所述第一单克隆抗体轻链rna在一个或者两个载体中编码；

89、所述第二基因工程载体中含有p6中所述的第二基因表达盒；

90、所述第二单克隆抗体重链rna和所述第二单克隆抗体轻链rna在一个或者两个载体中编码；

91、p8：细胞

92、所述细胞包括第一细胞，第二细胞或者所述第一细胞和所述第二细胞的组合；

93、所述第一细胞中含有p7中所述的第一基因工程载体；

94、所述第一基因工程载体的基因表达盒中的编码rna组成型表达或人工诱导型表达；

95、当所述第一单克隆抗体重链rna和所述第一单克隆抗体轻链rna在两个载体中编码时，所述两个载体在相同的细胞中或者不同的细胞中；

96、所述第二细胞中含有p7中所述的第二基因工程载体；

97、所述第二基因工程载体的基因表达盒中的编码rna组成型表达或人工诱导型表达；

98、当所述第二单克隆抗体重链rna和所述第二单克隆抗体轻链rna在两个载体中编码时，所述两个载体在相同的细胞中或者不同的细胞中；

99、p9：组合物

100、所述组合物为第一组合物、第二组合物或者所述第一组合物与所述第二组合物的组合；

101、所述第一组合物中含有p1中所述的第一单克隆抗体，p2中所述的单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合1，p3中所述的第一抗体衍生物，p4中所述的第一rna组合，p7中所述的第一基因工程载体或者p8中所述的第一细胞；

102、所述第二组合物中含有p1中所述的第二单克隆抗体，p2中所述的单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合2，p3中所述的第二抗体衍生物，p4中所述的第二rna组合，p7中所述的第二基因工程载体或者p8中所述的第二细胞；以及

103、p10：试剂盒

104、所述试剂盒为第一试剂盒、第二试剂盒或者所述第一试剂盒与所述第二试剂盒的组合；

105、所述第一试剂盒中含有p1中所述的第一单克隆抗体，p2中所述的单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合1，p3中所述的第一抗体衍生物，p4中所述的第一rna组合，p7中所述的第一基因工程载体或者p8中所述的第一细胞；

106、所述第二试剂盒中含有p1中所述的第二单克隆抗体，p2中所述的单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合2，p3中所述的第二抗体衍生物，p4中所述的第二rna组合，p7中所述的第二基因工程载体或者p8中所述的第二细胞。

107、在一些实施方式中，选自如下c1、c2、c3、c4中的任一种或其组合：

108、c1：在p1中，所述第一单克隆抗体是权利要求1所述的第一杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，和/或

109、所述第二单克隆抗体是权利要求1所述的第二杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体；

110、c2：在p2中，所述功能性蛋白片段为用于分离纯化蛋白的标签肽和/或信号肽；

111、c3：所述非洲猪瘟病毒p72蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；

112、c4：所述化学修饰抗体为胶体金标记的抗体。

113、本发明第一方面所述的杂交瘤细胞或者本发明第二方面所述的生物材料在制备用于识别、检测或鉴定非洲猪瘟病毒p72蛋白、含有非洲猪瘟病毒p72蛋白的非洲猪瘟病毒亚病毒颗粒或者非洲猪瘟病毒颗粒的制剂中的用途。

114、在一些实施方式中，所述非洲猪瘟病毒p72蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

115、本发明第三方面提供了一种用于检测生物物质的检测卡，所述检测卡中含有胶体金垫和检测线；

116、所述检测卡为第一检测卡或第二检测卡；

117、在所述第一检测卡中，所述胶体金垫中含有胶体金标记的单克隆抗体a，所述检测线中含有单克隆抗体b；

118、所述单克隆抗体a为本发明第二方面中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体中的任一种；所述单克隆抗体b为本发明第二方面中所述第一单克隆抗体和所述第二单克隆抗体中的另一种；

119、在所述第二检测卡中，所述胶体金垫中含有胶体金标记的单克隆抗体c，所述检测线中含有单克隆抗体d；或者所述胶体金垫中含有胶体金标记的单克隆抗体d，所述检测线中含有单克隆抗体c；

120、所述单克隆抗体c为本发明第二方面中所述第一单克隆抗体或者所述第二单克隆抗体；所述单克隆抗体d是小鼠源抗非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体igg，所述单克隆抗体d与本发明第二方面中所述第一单克隆抗体与所述第二单克隆抗体识别的抗非洲猪瘟病毒p72蛋白表位均不同；

121、所述生物物质选自：

122、包含非洲猪瘟病毒p72蛋白的混合液；

123、包含非洲猪瘟病毒颗粒的混合液；

124、包含含有非洲猪瘟病毒p72蛋白的非洲猪瘟病毒亚病毒颗粒的混合液。

125、在一些实施方式中，所述检测卡中还含有底板、样品垫、透水膜、吸水垫和质控线。

126、在一些实施方式中，在所述底板的一个侧面上从一端到另一端依次设置所述样品垫、所述胶体金垫、所述透水膜和所述吸水垫，所述质控线和所述检测线设置在所述透水膜上。

127、在一些实施方式中，在所述样品垫和所述金标垫之间还设置有滤血膜。

128、在一些实施方式中，选自如下s1、s2、s3、s4和s5中的任一种或其组合；

129、s1：所述非洲猪瘟病毒p72蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

130、s2：所述质控线上设置有抗小鼠igg抗体；

131、s3：所述透水膜为硝酸纤维素膜；

132、s4：所述底板为pvc板；

133、s5：所述非洲猪瘟病毒的genbank号为mz945537.1或mw656282.1，或者

134、所述非洲猪瘟病毒的微生物保藏编号为保藏号为：cctcc no:v201924。