一种S-腺苷蛋氨酸合成酶突变体及其应用

本发明涉及一种s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体及其应用，属于生物酶工程。

背景技术：

1、s-腺苷蛋氨酸(s-adenosyl-l-methionine，sam)是一种重要的代谢中间体，存在于所有已知生物体中，是生物正常进行生理活动所必需的。sam在细胞中的重要性主要体现在其参与细胞的转甲基反应、转硫基反应和转氨丙基反应，它不仅是生物体内甲基的主要供体，同样也是多胺生物合成中使用的氨基、丙基的前体。所以，在各种sam作为辅因子的反应中，它的重要性可能仅次于atp。在临床研究中，sam已被广泛应用于肝脏疾病、抑郁症、骨关节炎、神经系统疾病和其他疾病的治疗。随着sam市场需求的不断扩大，为工业生产提供一种低成本、高效的sam制造技术是必要的。

2、sam的生产可以通过化学合成、生物酶催化和微生物发酵来实现。由于纯在严格的反应条件、低生产率、环境污染严重和纯化困难等问题，目前化学合成的方法生产sam已被放弃。微生物发酵法生产sam因其条件易控、产量高、底物廉价、便于放大等优点而得到广泛应用。酿酒酵母具有高活性的s-腺苷甲硫氨酸合成酶(mat，ec2.5.1.6)，具有独特的液泡sam存储机制，因此广泛应用于sam生产，但该方法同时也存在着分离纯化成本高、生产周期长等问题。与前两种方法相比，生物酶催化法具有环境污染小、产品纯度高、纯化简单、生产周期短等优点。此外，酶工程和固定化酶的发展也使得酶法生产sam得到越来越多的关注。然而，酶促合成sam的主要挑战仍然是atp的昂贵以及mat的低催化效率。近年来，全细胞催化引起了广泛关注。与固定化酶相比，全细胞催化不需要酶的分离纯化，回收率高，降低了下游分离纯化成本，且细胞可以重复利用，有利于提高工业化生产sam的强度。但是全细胞催化法同时也需要高催化活性的s-腺苷蛋氨酸合成酶，所以目前有许多研究集中在尝试通过提高sam合成酶活性来工业生产sam。sam合成酶广泛存在于生物体中，包括细菌、真菌、昆虫、植物和哺乳动物等。近年来，来自大肠杆菌和酿酒酵母的sam合成酶已经得到了很好的工业应用特性。

3、甲硫氨酸腺苷转移酶(methionine adenosyltransferase，简称mat或者adomat，ec 2.5.1.6)是一种可以通过反应催化atp和l-甲硫氨酸合成s-腺苷甲硫氨酸的酶，是sam生物合成过程中的限速酶。目前，大肠杆菌和酿酒酵母来源的mat研究较多。通过酶学特性比较，大肠杆菌的mat具有较高的比活性和较好的可溶性表达。并且，从大肠杆菌中提取的mat的晶体结构和与amppnp和l-蛋氨酸络合的mat的晶体结构已经被报道，这使得基于其结构的理性或半理性重新设计获得高效的mat突变体成为可能。但是该酶的主要缺点是底物与产物的抑制严重限制了sam的合成。为了克服产物的抑制作用，需要在反应体系中加入高浓度的对甲苯磺酸钠，但是这也进一步增加了成本，且sam对甲苯磺酸盐作为药物的生物利用度较低。酿酒酵母中有两种mat，分别由sam1和sam2独立编码，并且他们的序列具有较高的同源性。但是和两种酶的结构与调控方式有所不同，sam合成酶1具有底物抑制性，在l-met过量时，细胞会下调sam1基因的表达，同时上调sam2基因的表达。sam2编码的sam合成酶2不受底物的抑制，并且大多数来源的sam合成酶均存在sam负反馈作用，即sam积累会抑制sam合成酶的酶活性，导致sam积累量不高，而酿酒酵母sam2编码的蛋白没有sam负反馈作用，因此常被用来进行sam积累。相关研究中指出，sam2合成酶基因的过表达在毕赤酵母、酿酒酵母和大肠杆菌中具有积极作用，但mat的活性极大的限制了sam的合成。因此，增加sam的产量需要提高mat的活性。

技术实现思路

1、针对目前工业生产s-腺苷蛋氨酸存在合成酶催化效率低，稳定性差的问题，为了克服现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种s-腺苷蛋氨酸合成酶活性提高的突变体，并提高其全细胞催化法合成s-腺苷蛋氨酸的产量，对于促进s-腺苷蛋氨酸的合成具有普遍的意义。

2、本发明采用的技术方案如下：

3、克隆了酿酒酵母来源的sam2基因编码的s-腺苷蛋氨酸合成酶mat，采用swiss-model建立蛋白模型，分析其蛋白质结构，将蛋白质与底物进行分子对接，选择位点进行定点突变，对突变后带的酶进行活性测定，确定对酶活性有重要影响的位点，然后进行组合突变，迭加突变优势，获得相比野生型活性及稳定性提高的突变体。

4、本发明提供一种s-腺苷蛋氨酸合成酶突变体，在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上，具有189位、200位、234位、371位的一个或多个位点突变。

5、在本发明的一种实施方式中，所述突变包括以下至少一种：

6、(1)将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸；

7、(2)将第234位谷氨酰胺突变为天冬酰胺；

8、(3)将第266位缬氨酸突变为组氨酸；

9、(4)将第371位天冬酰胺突变为精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或赖氨酸。

10、在本发明的一种实施方式中，所述突变包括以下任一种：

11、(1)将第371位天冬酰胺突变为精氨酸(n371r)；

12、(2)将第371位天冬酰胺突变为精氨酸，并将第200位天冬氨酸突变为谷氨酸(n371r/d200e)；

13、(3)将第371位天冬酰胺突变为精氨酸，并将第234位谷氨酰胺突变为天冬酰胺(n371r/q234n)；

14、(4)将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸，第266位缬氨酸突变为组氨酸，第371位天冬酰胺突变为精氨酸，并第234位谷氨酰胺突变为天冬酰胺(i189v/v266h/n371r/q234n)。

15、本发明还提供了编码所述突变体的基因。

16、本发明还提供了携带所述基因的表达载体。

17、本发明还提供了表达所述突变体，或携带所述表达载体的微生物细胞。

18、本发明还提供了一种重组大肠杆菌，以pet28a为载体，表达所述突变体。

19、本发明还提供了生产s-腺苷蛋氨酸的方法，以所述突变体或所述微生物细胞，或所述重组大肠杆菌为催化剂进行反应。

20、在本发明的一种实施方式中，将所述微生物细胞，或所述重组大肠杆菌在培养体系中培养至od600为0.6～0.8，加入诱导剂25℃诱导12-24h，收集菌体；将菌体添加至含有底物的反应体系中反应2h。

21、在本发明的一种实施方式中，将重组微生物细胞接种到含有卡那的10ml lb液体培养基中，37℃220rpm培养10-12h，再将2％的培养液转接新的含卡那的50ml lb液体培养基中培养，培养约2-3h使od＝0.6-0.8，加入过滤除菌的诱导剂iptg到终浓度为0.1mm，然后25℃220rpm培养12-24h，离心收集菌体。

22、在本发明的一种实施方式中，所述底物包括l-蛋氨酸(20～60mm)、腺苷-5’-三磷酸二钠盐(20～60mm)、氯化钾(20～60mm)、氯化镁(20～60mm)、谷胱甘肽(5-8mm)，控制菌株od600＝(3.2)±0.2，在ph8±1、37～60℃下反应。

23、本发明还提供了所述突变体或所述微生物细胞在制备s-腺苷蛋氨酸或含s-腺苷蛋氨酸的产品中的应用。

24、在本发明的一种实施方式中，所述产品包括食品、药品或日化用品。

25、有益效果：

26、(1)对s-腺苷蛋氨酸合成酶mat的189位、200位、234位、371位的一个或多个位点突变，得到了酶活提高的一系列突变体，将第371位天冬酰胺突变为精氨酸(n371r)，其比酶活较亲本分别提高了391.81％；将第371位天冬酰胺突变为精氨酸，并将第200位天冬氨酸突变为谷氨酸(n371r/d200e)，其比酶活较亲本分别提高了239.90％；将第371位天冬酰胺突变为精氨酸，并将第234位谷氨酰胺突变为天冬酰胺(n371r/q234n)，其比酶活较亲本分别提高了401.05％；将第189位异亮氨酸突变为缬氨酸，第266位缬氨酸突变为组氨酸，第371位天冬酰胺突变为精氨酸，并第234位谷氨酰胺突变为天冬酰胺(i189v/v266h/n371r/q234n)，其比酶活较亲本分别提高了294.57％，且189位、200位、234位、371位的单点突变其比酶活较亲本都有不同程度的提高，说明该突变体的酶活得到大大提升。

27、(2)通过全细胞催化比较催化性能，在催化2h，e.coli bl21-pet28a-sam2-n371r催化合成s-腺苷蛋氨酸的浓度为415.36mg/l，e.coli bl21-pet28a-sam2-n371r/d200e催化合成s-腺苷蛋氨酸的浓度为582.68mg/l，e.coli bl21-pet28a-sam2-n371r/q234n催化合成s-腺苷蛋氨酸的浓度为465.54mg/l，e.coli bl21-pet28a-sam2-i189v/v266h/n371r/q234n催化合成s-腺苷蛋氨酸的浓度为1749.40mg/l，而野生型e.coli bl21-pet28a-sam2在催化2h，合成sam浓度为276.32mg/l。