一种抗非洲猪瘟病毒P22蛋白抗体及其应用

本发明属于兽医生物制品领域，涉及一种抗非洲猪瘟病毒p22蛋白抗体及其应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染家猪、野猪引起的一种急性、出血性、烈性传染病。2018年8月，我国首例非洲猪瘟疫情在辽宁省沈阳市报告，造成重大经济损失和社会影响。序列分析证明最初传入我国的毒株为高毒力的基因ii型强毒株。随着非洲猪瘟病毒在我国的流行，田间检测并分离到中等毒力的基因ii型自然变异株和低毒力的基因i型毒株。这些毒株感染后潜伏期较长，症状轻微，排毒不规律，但仍具有较强的传播能力，更容易造成大面积扩散，对其根除更加困难。

2、asfv是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是唯一的虫媒dna病毒。病毒粒子具有复杂的二十面体对称结构，由基因组、核衣壳、内膜、衣壳和外膜5层组成。asfv编码150-167个开放阅读框(orf)，编码68个结构蛋白和100多个非结构蛋白。

3、asfv p22蛋白由kp177r基因编码，orf位于基因组的左端，分子量为22kda，为病毒感染后早期诱导表达的跨膜结构蛋白，位于病毒颗粒的内膜。p22蛋白n端含一个疏水区域，带有特征性的信号肽。p22蛋白确切功能目前尚不清楚，高通量方法和蛋白质组学分析表明，p22蛋白与细胞结构、信号转导和细胞黏附等生物学过程相关的细胞蛋白相互作用，有助于吞噬作用。研究报道利用杆状病毒表达的p22蛋白具有良好的免疫原性，免疫猪后可诱导特异性的p22抗体，因此可作为血清学检测的抗原。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明第一方面提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞为微生物保藏编号为cctcc no:c2024215的杂交瘤细胞；或者

2、微生物保藏编号为cctcc no:c2024215的杂交瘤细胞的传代细胞；

3、所述传代细胞分泌的单克隆抗体保持对非洲猪瘟病毒p22蛋白的特异性结合活性。

4、本发明第二方面一种生物材料，所述生物材料是如下p1、p2、p3、p4、p5、p6、p7、p8、p9和p10中的任一种；

5、p1：单克隆抗体

6、所述单克隆抗体保持对非洲猪瘟病毒p22蛋白的特异性结合活性；

7、所述单克隆抗体包括单克隆抗体重链和单克隆抗体轻链；

8、所述单克隆抗体重链包括重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3；

9、所述单克隆抗体轻链包括轻链cdr1、轻链cdr2和轻链cdr3；

10、所述重链cdr1蛋白序列如seq id no.4所示；

11、所述重链cdr2蛋白序列如seq id no.6所示；

12、所述重链cdr3蛋白序列如seq id no.8所示；

13、所述轻链cdr1蛋白序列如seq id no.10所示；

14、所述轻链cdr2蛋白序列如seq id no.12所示；

15、所述轻链cdr3蛋白序列如seq id no.14所示；

16、p2：单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合

17、所述单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合保持对非洲猪瘟病毒p22蛋白的特异性结合活性；

18、所述单克隆抗体重链包括重链cdr1、重链cdr2、重链cdr3与功能性蛋白片段或惰性蛋白片段的氨基酸序列；

19、所述单克隆抗体轻链包括轻链cdr1、轻链cdr2、轻链cdr3与功能性蛋白片段或惰性蛋白片段的氨基酸序列；

20、所述重链cdr1蛋白序列如seq id no.4所示；

21、所述重链cdr2蛋白序列如seq id no.6所示；

22、所述重链cdr3蛋白序列如seq id no.8所示；

23、所述轻链cdr1蛋白序列如seq id no.10所示；

24、所述轻链cdr2蛋白序列如seq id no.12所示；

25、所述轻链cdr3蛋白序列如seq id no.14所示；

26、p3：抗体衍生物

27、所述抗体衍生物保持对非洲猪瘟病毒p22蛋白的特异性结合活性；

28、所述抗体衍生物的蛋白序列部分含有重链cdr1、重链cdr2、重链cdr3、轻链cdr1、轻链cdr2和轻链cdr3；

29、所述重链cdr1蛋白序列如seq id no.4所示；

30、所述重链cdr2蛋白序列如seq id no.6所示；

31、所述重链cdr3蛋白序列如seq id no.8所示；

32、所述轻链cdr1蛋白序列如seq id no.10所示；

33、所述轻链cdr2蛋白序列如seq id no.12所示；

34、所述轻链cdr3蛋白序列如seq id no.14所示；

35、所述抗体衍生物的形式选自：酶标抗体、荧光标记抗体、化学修饰抗体、抗体fab片段、猪源化抗体、单链抗体、嵌合单克隆抗体和改型单克隆抗体；

36、p4：rna组合

37、所述rna组合包括单克隆抗体重链rna和单克隆抗体轻链rna；

38、所述单克隆抗体重链rna能够被翻译得到p1或p2中所述的单克隆抗体重链；

39、所述单克隆抗体轻链rna能够被翻译得到p1或p2中所述的单克隆抗体轻链；

40、p5：基因组合

41、所述基因组合的编码序列能够编码p1或p2中所述的单克隆抗体重链以及p1或p2中所述的单克隆抗体轻链；

42、p6：基因表达盒组合

43、所述基因表达盒组合中的基因表达产物为p4中所述的rna组合；

44、p7：基因工程载体

45、所述基因工程载体中含有p6中所述的基因表达盒；

46、所述单克隆抗体重链rna和所述单克隆抗体轻链rna在一个或者两个载体中编码；

47、p8：细胞

48、所述细胞中含有p7中所述的基因工程载体；

49、所述基因工程载体的基因表达盒中的编码rna组成型表达或人工诱导型表达；

50、当所述单克隆抗体重链rna和所述单克隆抗体轻链rna在两个载体中编码时，所述两个载体在相同的细胞中或者不同的细胞中；

51、p9：组合物

52、所述组合物中含有p1中所述的单克隆抗体，p2中所述的单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合，p3中所述的抗体衍生物，p4中所述的rna组合，p7中所述的基因工程载体或者p8中所述的细胞；以及

53、p10：试剂盒

54、所述试剂盒中含有p1中所述的单克隆抗体，p2中所述的单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合，p3中所述的抗体衍生物，p4中所述的rna组合，p7中所述的基因工程载体或者p8中所述的细胞。

55、在一些实施方式中，选自如下c1、c2、c3、c4中的任一种或其组合：

56、c1：在p1中，所述单克隆抗体是本发明第一方面所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体；

57、c2：在p2中，所述功能性蛋白片段为用于分离纯化蛋白的标签肽和/或信号肽；

58、c3：所述猪非洲猪瘟病毒p22蛋白序列如seq id no.2所示；

59、c4：所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的抗体。

60、本发明第三方面提供了本发明第一方面所述的杂交瘤细胞或者本发明第二方面所述的生物材料在制备用于识别、检测或鉴定非洲猪瘟病毒p22蛋白、含有非洲猪瘟病毒p22蛋白的非洲猪瘟病毒亚病毒颗粒或者非洲猪瘟病毒颗粒的制剂中的用途。

61、本发明第四方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒为第一试剂盒或第二试剂盒，所述试剂盒中含有固相表面，所述固相表面包被有非洲猪瘟病毒p22蛋白或含有非洲猪瘟病毒p22蛋白序列的融合蛋白；

62、所述第一试剂盒中还含有连接有第一标记的单克隆抗体1或连接有第一标记的单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合；

63、所述单克隆抗体1保持对非洲猪瘟病毒p22蛋白的特异性结合活性；

64、所述单克隆抗体1包括单克隆抗体重链1和单克隆抗体轻链1；

65、所述单克隆抗体重链1包括第一单克隆抗体重链cdr1、第一单克隆抗体重链cdr2和第一单克隆抗体重链cdr3；

66、所述单克隆抗体轻链1包括第一单克隆抗体轻链cdr1、第一单克隆抗体轻链cdr2和第一单克隆抗体轻链cdr3；

67、所述第一单克隆抗体重链cdr1蛋白序列如seq id no.4所示；

68、所述第一单克隆抗体重链cdr2蛋白序列如seq id no.6所示；

69、所述第一单克隆抗体重链cdr3蛋白序列如seq id no.8所示；

70、所述第一单克隆抗体轻链cdr1蛋白序列如seq id no.10所示；

71、所述第一单克隆抗体轻链cdr2蛋白序列如seq id no.12所示；

72、所述第一单克隆抗体轻链cdr3蛋白序列如seq id no.14所示；

73、所述单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合保持对非洲猪瘟病毒p22蛋白的特异性结合活性；

74、所述单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合包括单克隆抗体重链2与单克隆抗体轻链2；

75、所述单克隆抗体重链2包括第二单克隆抗体重链cdr1、第二单克隆抗体重链cdr2、第二单克隆抗体重链cdr3与功能性蛋白片段或惰性蛋白片段的氨基酸序列；

76、所述单克隆抗体轻链2包括第二单克隆抗体轻链cdr1、第二单克隆抗体轻链cdr2、第二单克隆抗体轻链cdr3与功能性蛋白片段或惰性蛋白片段的氨基酸序列；

77、所述第二单克隆抗体重链cdr1蛋白序列如seq id no.4所示；

78、所述第二单克隆抗体重链cdr2蛋白序列如seq id no.6所示；

79、所述第二单克隆抗体重链cdr3蛋白序列如seq id no.8所示；

80、所述第二单克隆抗体轻链cdr1蛋白序列如seq id no.10所示；

81、所述第二单克隆抗体轻链cdr2蛋白序列如seq id no.12所示；

82、所述第二单克隆抗体轻链cdr3蛋白序列如seq id no.14所示；

83、所述第二试剂盒中还含有单克隆抗体2以及连接有第二标记的小鼠igg特异性结合物；

84、所述单克隆抗体2为本发明第一方面所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

85、在一些实施方式中，选自如下d1、d2、d3、d4、d5中的任一种或其组合：

86、d1：所述单克隆抗体1为本发明第一方面所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体；

87、d2：所述固相表面为微孔板的孔内表面；

88、d3：所述猪非洲猪瘟病毒p22蛋白序列如seq id no.2所示；

89、d4：所述第一标记为辣根过氧化物酶或荧光分子；

90、d5：所述第二标记为辣根过氧化物酶或荧光分子。

91、在一些实施方式中，所述试剂盒中还含有如下材料中的任一种或更多种的组合：

92、非洲猪瘟病毒抗体阳性血清；

93、非洲猪瘟病毒抗体阴性血清；

94、tmb底物显色液；

95、pbs溶液；

96、pbst溶液；

97、脱脂乳溶液；

98、硫酸水溶液。

99、本发明第五反面提供了一种非诊断目的的检测非洲猪瘟病毒抗体的方法，所述方法为方法1或方法2；

100、所述方法1包括如下步骤：

101、p1：用非洲猪瘟病毒p22蛋白或含有非洲猪瘟病毒p22蛋白序列的融合蛋白包被固相表面，得到包被的固相表面；

102、p2：将待检样本添加到所述包被的固相表面进行孵育，得到第一次孵育的固相表面；

103、p3：将连接有第一标记的单克隆抗体1或连接有第一标记的单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合添加到所述第一次孵育的固相表面进行孵育，得到第二次孵育的固相表面；

104、所述单克隆抗体1保持对非洲猪瘟病毒p22蛋白的特异性结合活性；

105、所述单克隆抗体1包括单克隆抗体重链1和单克隆抗体轻链1；

106、所述单克隆抗体重链1包括第一单克隆抗体重链cdr1、第一单克隆抗体重链cdr2和第一单克隆抗体重链cdr3；

107、所述单克隆抗体轻链1包括第一单克隆抗体轻链cdr1、第一单克隆抗体轻链cdr2和第一单克隆抗体轻链cdr3；

108、所述第一单克隆抗体重链cdr1蛋白序列如seq id no.4所示；

109、所述第一单克隆抗体重链cdr2蛋白序列如seq id no.6所示；

110、所述第一单克隆抗体重链cdr3蛋白序列如seq id no.8所示；

111、所述第一单克隆抗体轻链cdr1蛋白序列如seq id no.10所示；

112、所述第一单克隆抗体轻链cdr2蛋白序列如seq id no.12所示；

113、所述第一单克隆抗体轻链cdr3蛋白序列如seq id no.14所示；

114、所述单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合保持对非洲猪瘟病毒p22蛋白的特异性结合活性；

115、所述单克隆抗体重链与单克隆抗体轻链组合包括单克隆抗体重链2与单克隆抗体轻链2；

116、所述单克隆抗体重链2包括第二单克隆抗体重链cdr1、第二单克隆抗体重链cdr2、第二单克隆抗体重链cdr3与功能性蛋白片段或惰性蛋白片段的氨基酸序列；

117、所述单克隆抗体轻链2包括第二单克隆抗体轻链cdr1、第二单克隆抗体轻链cdr2、第二单克隆抗体轻链cdr3与功能性蛋白片段或惰性蛋白片段的氨基酸序列；

118、所述第二单克隆抗体重链cdr1蛋白序列如seq id no.4所示；

119、所述第二单克隆抗体重链cdr2蛋白序列如seq id no.6所示；

120、所述第二单克隆抗体重链cdr3蛋白序列如seq id no.8所示；

121、所述第二单克隆抗体轻链cdr1蛋白序列如seq id no.10所示；

122、所述第二单克隆抗体轻链cdr2蛋白序列如seq id no.12所示；

123、所述第二单克隆抗体轻链cdr3蛋白序列如seq id no.14所示；

124、p4：表征与所述第二次孵育的固相表面间接相结合的所述第一标记，根据所述第一标记的有无判定所述待检样本中是否存在非洲猪瘟病毒抗体；

125、所述方法2包括如下步骤：

126、s1：用非洲猪瘟病毒p22蛋白或含有非洲猪瘟病毒p22蛋白序列的融合蛋白包被固相表面，得到包被的固相表面；

127、s2：将待检样本添加到所述包被的固相表面进行孵育，得到第一次孵育的固相表面；

128、s3：将单克隆抗体2添加到所述第一次孵育的固相表面进行孵育，得到第二次孵育的固相表面；

129、所述单克隆抗体2为本发明第一方面所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体；

130、s4：将连接有第二标记的小鼠igg特异性结合物加入到第二次孵育的固相表面，得到第三次孵育的固相表面；

131、s5：表征与所述第三次孵育的固相表面间接相结合的所述第二标记，根据所述第二标记的有无判定所述待检样本中是否存在非洲猪瘟病毒抗体。

132、在一些实施方式中，选自如下e1、e2、e3、e4、e5中的任一种或其组合：

133、e1：所述单克隆抗体1为本发明第一方面所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体；

134、e2：所述固相表面为微孔板的孔内表面；

135、e3：所述猪非洲猪瘟病毒p22蛋白序列如seq id no.2所示；

136、e4：所述待检样本为溶液状态的样本；

137、e5：所述小鼠igg特异性结合物为抗小鼠igg抗体。

138、在一些实施方式中，选自如下f1、f2、f3中的任一种或其组合：

139、f1：在步骤p1、p2、p3、s1、s2、s3和s4中任一步骤完成后，用pbs或pbst清洗所述固相表面；

140、f2：所述第一标记为辣根过氧化物酶，用tmb底物显色液表征所述第一标记，测定od450nm值来判断所述待检样本中是否含有抗非洲猪瘟病毒p22蛋白抗体；

141、f3：所述第二标记为辣根过氧化物酶，用tmb底物显色液表征所述第二标记，测定od450nm值来判断所述待检样本中是否含有抗非洲猪瘟病毒p22蛋白抗体。