一种生产对羟基肉桂酸的方法与流程

本发明涉及生物，具体而言，涉及一种生产对羟基肉桂酸的方法。

背景技术：

1、对羟基肉桂酸，又称对香豆酸，是一种天然的酚类化合物，广泛存在于植物中，具有抗突变、抗遗传毒性、抗微生物活性、抗氧化、美白等功效，广泛应用于食品、化妆品及医药等领域。

2、对羟基肉桂酸的制备方法主要有提取法、化学合成法及生物转化法。提取法主要以天然植物为原料，经酸或碱水解处理，再经有机溶剂萃取获得对羟基肉桂酸，提取步骤复杂、成本高，限制了这种方法的工业化应用。化学合成法主要通过缩合反应制备对羟基肉桂酸，合成过程中易产生有毒副产物，收率低且分离纯化成本高，阻碍了其大规模应用。生物转化法具备特异性高、绿色环保、反应条件温和及无需多步分离纯化等优点，目前已经受到了广泛的关注。

3、目前，国内外学者报道了一些对羟基肉桂酸的生物法制备路线，例如yuqi liu等在大肠杆菌中表达苯丙氨酸解氨酶(rgpal)，并通过全细胞催化l-酪氨酸制备对羟基肉桂酸，在最优条件下，对羟基肉桂酸的产量仅为525mg/l，转化率为57.9％。例如中国专利cn117965514a对zea mays来源的苯丙氨酸解氨酶(zmpal2)进行分子改造，获得最优的zmpal2突变体，通过其转化l-酪氨酸制备对羟基肉桂酸，对羟基肉桂酸的最高产量达3.12g/l。

4、现有技术中生物合成法制备对羟基肉桂酸具有底物成本高、产量低、转化率低、生产效率低等缺点，因此，如何开发一条成本低、底物来源广、产量高、转化率高、生产效率高的对羟基肉桂酸制备方法是本领域研究人员亟需解决的问题。

5、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种生产对羟基肉桂酸的方法，该方法是通过构建表达异源的醛缩酶和富马酸酶的重组菌，再以其作为生物催化剂将廉价底物对羟基苯甲醛、乙酸转化获得对羟基肉桂酸。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、如图1所示，本发明采用的对羟基肉桂酸合成途径为：通过醛缩酶(ald)将对羟基苯甲醛及乙酸转化为3-羟基-3-(4-羟基苯基)丙酸，通过富马酸酶(fr)将3-羟基-3-(4-羟基苯基)丙酸转化为对羟基肉桂酸。本发明基于图1所示的对羟基肉桂酸合成途径设计了一种新的重组菌，其能够表达该合成途径的关键酶，即ald和fr。发明人从众多来源的ald和fr中各筛选出三种对羟基肉桂酸生产效率较高的酶。

4、其中，ald包括来源于sulfurihydrogenibium sp.的ssald，来源于lachnellulahyalina的lhald，以及来源于geobacter sp.的gsald。

5、fr包括来源于halanaerobium praevalens的hpfr，来源于oceanithermusprofundus的opfr，以及来源于acetohalobium arabaticum的aafr。

6、ssald的genbank编号为acd65676.1，其氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.4所示；lhald的genbank为编号tvy29750.1，其氨基酸序列如seq id no.2所示，核苷酸序列如seq id no.5所示；gsald的genbank编号为gfe61120.1，其氨基酸序列如seq id no.3所示，核苷酸序列如seq id no.6所示。

7、hpfr的genbank编号为ado76634.1，其氨基酸序列如seq id no.7所示，核苷酸序列如seq id no.10所示；opfr的genbank为编号adr36409.1，其氨基酸序列如seq id no.8所示，核苷酸序列如seq id no.11所示；aafr的genbank编号为adl12064.1，其氨基酸序列如seq id no.9所示，核苷酸序列如seq id no.12所示。

8、上述重组菌的构建方法包括：将ald和fr的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至出发菌株中，即获得重组菌。

9、在一些实施例中，重组菌的出发菌株为大肠杆菌。在其他实施方式中，重组菌的出发菌株可以是其他菌株，本发明不对其进行具体的限定。

10、在一些实施例中，大肠杆菌选自escherichia colibl21(de3)、escherichiacolidh5α和escherichia colixl-blue中的任意一种。

11、在一些实施例中，表达载体包括pcdfduet-1质粒和pacycduet-1质粒。

12、通过以上表达载体可以构建如下重组载体：pcdfduet-ssald、pcdfduet-lhald、pcdfduet-gsald、pacycduet-hpfr、pacycduet-opfr和pacycduet-aafr。

13、较为优选地，在构建重组大肠杆菌时，pcdfduet-lhald和pacycduet-opfr的组合能够使对羟基肉桂酸产量更高。

14、进一步地，本发明在此基础上还提供了一种全细胞催化剂，其含有上述的重组菌。

15、将上述重组菌作为全细胞催化剂，其表达的ald和fr能够高效地将对羟基苯甲醛、乙酸转化为对羟基肉桂酸。

16、本发明还提供了上述重组菌在合成对羟基肉桂酸及其下游产物中的应用。基于此，本发明可用该重组菌生产对羟基肉桂酸，方法如下：

17、将上述重组菌加入到含有对羟基苯甲醛和乙酸的反应体系中进行全细胞催化，获得对羟基肉桂酸。

18、在一些实施例中，在进行全细胞转化前对重组菌进行诱导培养，该诱导培养过程为：将重组菌接种至含30-60mg/l氯霉素和30-60mg/l链霉素的lb培养基中，培养后获得种子液，然后将种子液接种至新鲜的lb培养基中，至菌浓od600nm达0.6-0.8，添加诱导剂，诱导后分离、清洗即得湿菌体。

19、在一些实施例中，上述重组菌的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm，培养时间为10-16h。

20、在一些实施例中，上述种子液的培养条件为：温度为32-38℃，转速为150-250rpm。

21、在一些实施例中，上述诱导条件为：诱导剂0.2-0.6mm iptg，温度为25-30℃，时间为10-16h。

22、在一些实施例中，上述分离、清洗条件为：转速为7500-8500rpm，离心时间为5-15min；用盐水清洗湿菌体，盐水浓度为0.9％。

23、在一些实施例中，全细胞催化的反应体系包括：重组菌湿重1-10g/l，对羟基苯甲醛1-60g/l，乙酸1-35g/l，磷酸吡哆醛(plp)0.01-0.05g/l。

24、在一些实施例中，全细胞催化的反应条件为：ph＝6.0-9.0，温度为15-40℃，转速为150-250rpm，反应时间为8-24h。

25、本发明具有以下有益效果：

26、本发明以大肠杆菌为出发菌株构建了能够高效合成对羟基肉桂酸的重组菌株，该重组菌的基因组上整合了异源的醛缩酶和富马酸酶的基因，其能够以对羟基苯甲醛、乙酸为底物高效合成对羟基肉桂酸。其中，对羟基苯甲醛及乙酸来源广、制备过程简单且价格低廉，是理想的底物，本发明选择的酶具有活性高、光学专一性强等优势，因此，利用本发明的重组菌转化生产对羟基肉桂酸，产量高、转化率高、生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。