RHOGTP酶激活蛋白7基因LeRGA7在调控香菇单菇重及早熟性中的应用

本发明属于真菌基因工程领域，具体涉及一种从香菇(lentinula edodes)中分离克隆的rho gtp酶激活蛋白7基因lerga7，利用基因工程技术过表达lerga7基因能够提早香菇原基形成时间和成熟子实体形成时间，增加单菇重，减少菇数，不显著影响单袋香菇产量。

背景技术：

1、香菇是一种重要的人工栽培食用菌，其人工栽培主要集中在亚洲地区，包括日本、韩国和中国的大部分地区。2020年香菇产量超过千万吨，是在中国生产规模最大，世界上消费量最高的食用菌(li c,xu s.edible mushroomindustry in china:current state andperspectives.appl microbiol biotechnol,2022,106(11):3949-3955.)。香菇香气独特，味道鲜美，素有“菇中皇后”、“山珍”等美誉(chang,s.t.past and present trends in theproduction of lentinula edodes in asia.mushroom biology and mushroomproducts.2002.4:1-8.)。并且香菇富含蛋白质、氨基酸、多种维生素及矿质元素，具有防治肿瘤、增加免疫力、降血脂、抗血栓、健胃保肝等功效(边银丙.食用菌栽培学(第3版).北京：高等教育出版社.2017.138-140)，因其具有的较高营养价值和药用价值，深受人们喜爱。

2、重要农艺性状的遗传改良是香菇产业可持续发展的基础(龚文兵等.基于f2群体的香菇遗传图谱构建及其在qtl定位中的应用.菌物学报.2014.33:297-311)。香菇重要农艺性状多是数量性状，如产量、子实体数量(菇数)、单菇重、早熟性、菌丝生长速度等(肖扬等.关联分析及其在真菌遗传学研究中的应用.菌物学报.2016.35:782-790)。不同于质量性状，数量性状大多表现为连续变异，受多基因协同调控，遗传基础复杂，且易受环境因素影响，表型和基因型间没有明确对应关系，难以进行遗传改良(santoyo,f.etal.quantitative linkage mapping of lignin degrading enzymatic activities inpleurotus ostreatus.enzyme and microbial technology.2008.43(2):137-143.)。自20世纪80年代以来，随着分子生物学和数量遗传学的发展，通过构建分子标记遗传连锁图谱和自然群体，进行数量性状位点(quantitative trait loci,qtl)的连锁分析和关联分析，进一步分析重要性状调控基因的功能及开发高效的分子育种工具，为解析数量性状遗传基础，进行遗传改良提供了有效途径(龚文兵等.食用菌qtl定位研究进展.园艺学报.2011.38:1800-1806.)。

3、香菇的早熟性与单菇重也属于复杂的数量性状。研究发现，早熟性性状与子实体形态特征负相关，与产量性状负相关，即出菇越早，子实体越大，子实体单菇重越大，产量越高(gong,w.b.et al.phenotypic evaluation and analysis of important agronomictraits in the hybrid and natural populations of lentinula edodes.scientiahorticulturae.2014,179:271-276)。此外，gong等人也对香菇菇数、单菇重、早熟性、菌盖直径、菌盖厚度、菌盖重量、菌柄直径、菌柄长度、菌柄重量等一系列重要农艺性状进行了系统的qtl定位研究(gong,w.b.et al.constructing a new integrated genetic linkagemap and mapping quantitative trait loci for vegetative mycelium growth ratein lentinula edodes.fungal biology.2014.118:295-308.gong,w.b.et al.geneticdissection of fruiting body-related traits using quantitative trait locimapping in lentinula edodes.applied microbiology and biotechnology.2016.100:5437-5452.gong,w.b.et al.detection of quantitative trait loci underlyingyield-related traits in lentinula edodes(agaricomycetes).internationaljournal of medicinal mushrooms.2018.20(5):451-458.)。zhang等人基于香菇超高密度遗传图谱和染色体水平基因组，利用系统遗传分析，发现了3个调控产量、早熟性与子实体形态性状qtls热点区域，挖掘出211个调控菇数性状的重要候选基因，33个调控香菇早熟性状的重要候选基因(zhang,l.et al.rna-seq-based high-resolution linkage mapreveals the genetic architecture of fruiting body development in shiitakemushroom,lentinula edodes.computational and structural biotechnologyjournal.2021.19:1641-1653.)。

4、林范学在香菇中发现了8个与马铃薯葡萄糖培养基(potato dextrose agar,pda)上菌丝长速相关的qtl位点，5个木屑培养基上菌丝长速相关的qtl位点；并且发现菌丝长速和木霉抗性这两个性状之间存在显著的正相关(林范学.香菇分子遗传图谱构建和数量性状座位(qtl)分析[博士学位论文].武汉：华中农业大学图书馆.2008.)。基于171个f2双核体菌株，龚文兵等人构建了第一张双核体香菇遗传图谱，并定位到6个与麦芽浸膏培养基(malt extract medium,myg)上菌丝长速相关的qtl位点，对性状变异的贡献率为50.11％(龚文兵等.基于f2群体的香菇遗传图谱构建及其在qtl定位中的应用.菌物学报.2014.33:297-311.)。li等人利用关联分析方法研究了与11个香菇农艺性状相关的遗传位点，发现了43个分子标记与4个性状间的显著关联，涉及97个候选基因(li,c.et al.associationmapping reveals genetic loci associated with important agronomic traits inlentinula edodes,shiitake mushroom.frontiers in microbiology 2017.8:237.)。

5、总体而言，香菇重要数量性状遗传基础研究尚处于起步阶段，主要集中在qtl候选基因挖掘，基因功能验证鲜有报道。

6、本发明中，发明人通全基因组关联分析解析香菇两年栽培试验数据，最终定位到一个香菇菇数调控的候选基因lerga7，功能研究表明lerga7基因在不影响产量的前提下，正调控单菇重与早熟性，负调控菇数。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种从香菇中克隆出来的调控早熟性与单菇重的基因lerga7，其基因全长为3563bp，序列如seq id no.1所示，开放阅读框长度为1980bp，序列如seq id no.2所示，编码氨基酸序列如seq id no.3所示。

2、本发明的第二个目的在于提供了一种rho gtp酶激活蛋白7基因lerga7在调控早熟性与单菇重中的应用。构建该基因的干扰表达载体和超量表达载体，并通过农杆菌介导的遗传转化方法将其转入香菇，鉴定其生物学功能。

3、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

4、一、基因的来源

5、lerga7基因编码的rho gtp酶激活蛋白7，属于小g蛋白rho家族的成员，能够转导来自质膜受体的信号，并通过肌动蛋白细胞骨架的形成控制细胞粘附、运动和形状(vicente-soler,jero et al.the multiple functions of rho gtpases in fissionyeasts.cells.2021；10(6):1422.)。与所有其他gtp酶一样，rho蛋白充当分子开关，具有活性gtp结合形式和非活性gdp结合形式。鸟嘌呤核苷酸交换因子促进活性构象，gtp酶激活蛋白(gap)促进非活性状态，后者刺激小g蛋白的内在gtp酶活性。lerga7由七个α螺旋组成，具有rho/rac/cdc42样gap结构域，该结构域存在于多种大的多功能蛋白质中。对133个香菇菌株开展两年的栽培试验，系统考察原基期、出菇期和单菇重等11个重要农艺性状的表型。通过全基因组关联分析发现，lerga7(香菇的rga7基因)为调控香菇菇数的重要候选基因(图1)。

6、二、基因的克隆

7、以香菇单核体wpm-1基因组数据为参考序列，设计基因引物，lerga7-dna-f：5’-accgttcaactcccagacctt-3’，lerga7-dna-r：5’-gtttgaaaacgcatattatttatttcg-3’；cnda引物：lerga7-cdna-f：5’-atgcatgaggaagggtactc-3’，lerga7-cdna-r：5’-tcattcagaatcgtcgacaa-3’。以香菇栽培菌株wx-1(“武香1号”)dna为模板，扩增得到lerga7基因全长，wx-1菌株cdna为模板，扩增得到lerga7 cdna序列。

8、序列分析结果显示：lerga7基因全长为3563bp，包含13个外显子和12个内含子(图2a)，开放阅读框全长为1980bp，编码rho gtp酶激活蛋白7。lerga7基因全长序列如seq idno.1所示，开放阅读框序列如seq id no.2所示，编码蛋白质氨基酸序列如seq id no.3所示。对基因编码蛋白的理化性质进行分析，结果表明其包含659个氨基酸，分子式为c3188h5060n922o1027s21，分子量73.4kda，理论等电点为5.74。蛋白结构域由两部分组成：n端的fch结构域是一个短的保守区域，大约有60个氨基酸，c端类似于rho/rac/cdc42的gap结构域，存在于多种大型多功能蛋白中(图2b)，蛋白质结构预测由七个α螺旋组成(图2c)。

9、三、过表达载体(oe)和干扰载体(rnai)构建

10、过表达载体构建：用ecor-ⅰ和kpn-ⅰ对质粒pcambia1300-g(图3a)进行双酶切，用1％琼脂糖凝胶电泳检测回收。根据酶切位点两端核苷酸序列，设计重组引物oe-f：5’-attgactgcttgaatggtaccaccgttcaactcccagacctt-3’和oe-r：5’-gggaaattcgagctcgaattcgtttgaaaacgcatattatttatttcg-3’扩增 lerga7基因片段。引物 legpd-f：5’-tgccactggctgaaaagacatggattgagcca-3’和 legpd-r：5’-tctagaggatccccgggtaccgtacatcccttgctctgc-3’扩增香菇legpd启动子片段。纯化回收pcr扩增产物。将线性化片段pcambia1300-g、legpd启动子片段、lerga7基因片段按一步克隆法进行同源重组，pcr仪中50℃反应15min后转化至大肠杆菌感受态细胞trans-t1，以引物cx-poe-nploya-f：5’-catgcttaacgtaattcaacag-3’，lerga7-oe-f：5’-attgactgcttgaatggtaccaccgttcaactcccagacctt-3’进行阳性克隆测序检测。提取阳性克隆的载体质粒，即为重组过表达载体lerga7-oe(图3b)。

11、rnai载体构建：用ecor-ⅰ和kpn-ⅰ对质粒pcambia1300-g进行双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳检测回收。根据酶切位点两端核苷酸序列，设计重组引物 rnai-f ：5’-attgactgcttgaatggtacctagaaatacctctgattatgaagaaatgtt-3’ 和rnai-r：5’-ctcgcagctcttcacgaattccagtatagtggttgaggatcgtctct-3’，以扩增543bp lerga7基因保守区片段。重组引物leactin-f：5’-ccacctcaaacttcggaattcgcagtatttatacctacggagcg-3’g和leactin-r：5’-tcttccgagcgtgaagagctgcgagtgttg-3’扩增香菇leactin启动子片段。纯化回收pcr扩增产物。将线性化片段pcambia1300-g、legpd启动子片段、leactin启动子片段、lerga7基因保守区片段按一步克隆法进行同源重组，pcr仪中50℃反应15min后转化至大肠杆菌感受态细胞trans-t1，以引物rnai-f：5’-attgactgcttgaatggtacctagaaatacctctgattatgaagaaatgtt-3’和rnai-r：5’-ctcgcagctcttcacgaattccagtatagtggttgaggatcgtctct-3’进行阳性克隆测序检测。提取阳性克隆的载体质粒，即为重组干扰载体lerga7-rnai(图3c)。

12、四、香菇的遗传转化及表型分析

13、利用农杆菌介导的遗传转化法转化香菇wx-1菌株，经五次筛选，得到稳定的oe/rnai阳性转化子(图4)。在工厂化条件下下进行栽培试验，统计菇数、单菇重、原基形成时间、子实体形成时间、菌柄长度等农艺性状。结果发现，lerga7基因的表达可以正向调控香菇单菇重、早熟性，负向调控菇数，不显著影响产量。

14、经实验证实，与对照空载菌株相比，超表达菌株单袋总菇数减少了34.14％，rnai菌株单袋菇数增加了61.76％(图5)。

15、超表达菌株单菇重增加了33.10％，rnai菌株单菇重减少了46.49％(图5)。超表达菌株出菇时间提前4-5天，rnai菌株出菇时间延迟1-2天(图5)。超量表达该基因，能缩短香菇原基和子实体形成时间，表明其能够调节香菇的生长周期，对香菇早熟性具有一定的调控作用；同时发现该基因正向调控子实体其他性状(菌盖直径、菌柄长度)，不显著影响单袋香菇产量。

16、与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

17、本发明是国内外首次公开lerga7基因在调控香菇菇数和早熟性中的作用。基于133个菌株两年的栽培试验数据进行全基因组关联分析，获得菇数调控的候选基因lerga7。本发明实验结果表明与空载对照菌株相比，超表达菌株在不显著影响产量的前提下单菇重增加了33.10％，单袋总菇数减少了34.14％，出菇时间提前4-5天。