一种密码子优化的GALC基因及腺相关病毒和应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种密码子优化的 galc基因及腺相关病毒和应用。

背景技术：

1、球状细胞脑白质营养不良，亦称克拉伯病(krabbe disease)，是一种遗传性疾病，由 galc基因突变所致。1916年，丹麦神经学家knud krabbe首次详尽描述此病，故该病以其命名。克拉伯病的主要特征为半乳糖神经酰胺酶(galc)的缺乏，该酶负责在正常髓鞘磷脂代谢过程中分解半乳糖苷、半乳糖脑苷脂及半乳糖基鞘氨醇等，产生对髓鞘合成和维护至关重要的代谢物如鞘氨醇和神经酰胺。galc缺乏导致半乳糖苷鞘氨醇以及半乳糖神经酰胺在细胞中积聚，进而在中枢神经系统形成球状细胞，且在周围神经系统的组织细胞中引发神经脱髓鞘和严重的神经系统疾病。

2、克拉伯病通常在婴儿期被诊断，若未能及时治疗，患者可能在2至3年内因严重脱髓鞘以及器官衰竭而死亡。常见症状包括烦躁、瘫痪、失明、听力丧失和癫痫发作。目前，临床治疗克拉伯病的唯一方法是造血干细胞移植，但该方法仅可部分减缓克拉伯病的进展，仍然不能治愈该疾病。此外，移植手术必须在患者出现症状之前进行，造血干细胞移植后患者仍会出现进行性的神经系统退化，生活质量降低。因此，开发新的治疗方法刻不容缓。

3、近年来，在克拉伯病模型小鼠中已开发出多种治疗策略，包括病毒介导的基因治疗、galc酶替代疗法、底物减少疗法和抗炎疗法等。基因治疗，特别是通过病毒载体传递功能性 galc基因以替换突变基因的方法，因其直接针对疾病的遗传根源而受到广泛关注。初期基因治疗主要采用逆转录病毒载体和腺病毒载体，但由于这些载体可能带来较高的致瘤风险和免疫毒性，不适合临床应用。相比之下，重组腺相关病毒因其高效的体内转导效率、低免疫原性和良好的临床安全性，成为治疗单基因遗传病的首选载体。

4、早在2005年，sands以及wenger两个研究组就发表了以aav为载体开展的克拉伯基因治疗的研究。到目前为止，已经在twitcher小鼠模型中测试了多种不同的aav血清型。研究结果显示，无论何种aav血清型，基因治疗后中位寿命仅从40天增加到70天左右，其中aav病毒的剂量与小鼠的生存期在一定的范围内存在着剂量依赖关系。总之，aav基因治疗对克拉伯模型小鼠生存期的延长效果十分有限。其中最主要的原因与aav载体介导 galc基因的表达水平不够高密切相关，这也是克拉伯基因治疗研究开展较早，但目前为止仍没有克拉伯基因治疗药物获批上市的主要原因之一。

5、在基因疗法中，提高递送基因的表达产量至关重要。密码子优化是一种基因工程技术，可通过修改dna或mrna序列中的密码子来提高特定蛋白质的表达水平，而不改变蛋白质的氨基酸序列。通过对 galc密码子优化提高galc蛋白表达水平，有以下优点：

6、增强治疗效果：高水平的 galc基因表达能够更有效地补充功能异常的蛋白，从而改善或逆转疾病的症状。

7、降低治疗剂量需求：通过提高 galc基因表达水平可以降低所需的病毒载体剂量。这不仅可以减少生产成本，还可以降低患者体内病毒载体的总量，从而减少潜在的免疫反应和副作用。

8、提高治疗的持久性：通过提高基因表达水平，减少需要重复治疗的次数。这对于患者来说意味着更少的不便和更低的治疗成本。

9、减少副作用：通过优化 galc基因表达水平，可以在不牺牲治疗效果的前提下，使用更低的病毒载体剂量，从而减少免疫反应和其他潜在副作用。

10、发明旨在克服现有技术中因 galc基因突变所引起的克拉伯病治疗策略存在的缺陷和不足。通过提供一种经过密码子优化的 galc基因，本发明实现了相较于野生型 galc基因更高的表达水平。这一改进将显著降低克拉伯治疗所需药物的剂量，从而优化了治疗方案。此外，本发明还介绍了一种利用aav载体的克拉伯病基因治疗药物的制备方法，为克拉伯病的有效治疗提供了新的途径。综上所述，本发明具有重要的临床意义和转化应用价值。

技术实现思路

1、针对上述技术问题，本发明提供一种密码子优化的 galc基因及携带密码子优化 galc的腺相关病毒及其应用。

2、为了实现上述目的，本发明提供一种密码子优化的 galc基因，所述 galc基因的序列为seq id no:2。

3、优选的，通过dnaman软件进行序列一致性比对，所述序列优化的 galc基因与野生型 galc基因序列具有76%同源性；所述野生型 galc基因序列为seq id no:1。

4、本发明还提供一种密码子优化的 galc基因在制备治疗克拉伯病药物中的应用。

5、本发明还提供一种携带密码子优化的 galc基因的重组腺相关病毒表达载体，包括密码子优化的 galc基因和含有cba启动子的腺相关病毒表达载体。

6、优选的，所述腺相关病毒表达载体paav-cba-galc-opt-flag的序列为seq id no:3，所述密码子优化的 galc基因序列为seq id no:2。

7、进一步优选的，所述腺相关病毒衣壳表达质粒为paav1、paav2、paav5、paav9和paav10中的任一种。

8、本发明还提供一种携带密码子优化的 galc基因的重组腺相关病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：

9、（1）对 galc基因进行密码子优化，并在3’端添加flag接头，合成后利用pcr技术在5’端和3’端分别加上保护碱基和bamh i/xho i酶切位点，得到galc-opt-flag基因片段；

10、（2）将galc-opt-flag基因片段和paav-cba-luc质粒分别双酶切后回收纯化，然后用t4 dna连接酶连接，得到连接产物；

11、（3）将连接产物转化至大肠杆菌，过夜培养后挑取单克隆扩增提取质粒检测，得到重组腺相关病毒表达载体paav-cba-galc-opt-flag。

12、优选的，步骤（2）所述的双酶切使用的限制性核酸内切酶为bamh i和xho i，酶切条件为37℃酶切2h；

13、优选的，步骤（3）所述的连接条件为16℃连接16h。

14、本发明还提供一种携带密码子优化的 galc基因的重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒包含aav衣壳，包装在aav衣壳中的aav基因组、cba启动子以及密码子优化的galc基因序列；所述密码子优化的galc基因序列为seq id no:2，且与seq id no:1所示野生型galc基因片段具有76%同源性。

15、本发明还提供一种携带密码子优化的 galc基因的重组腺相关病毒的制备方法，所述制备方法包括包装方法和纯化方法，其中包装方法为采用三质粒包装体系将paav-cba-galc-opt-flag、phelper、paav9共转染hek293t细胞，转染后收集上清与细胞用于纯化；

16、其中纯化方法为采用碘克沙醇密度梯度离心法进行纯化。

17、本发明还提供一种携带密码子优化的 galc基因的重组腺相关病毒在制备治疗克拉伯病药物中的应用。

18、本发明的有益效果在于：

19、1、提供了一种经过密码子优化的 galc基因，该基因与野生型 galc基因保持较高的同源性，同时展现了更高的蛋白表达效率。

20、2、通过将该优化后的 galc基因与腺相关病毒表达载体进行重组，我们成功构建了paav-cba-galc-opt-flag重组质粒，并进一步包装纯化，得到aav5-cba-galc-opt-flag重组病毒。此重组病毒能显著提升gld脑类器官中神经干细胞的galc活性，有效降低psychosine的浓度。这一特性不仅有利于降低治疗所需的剂量，增强治疗效果，提高治疗的持久性，并减少副作用，而且还有望显著降低克拉伯病基因治疗药物的成本。