一种朱顶红属CAPS分子标记及其在品种鉴定中的应用的制作方法

本发明属于基因工程，具体涉及一种朱顶红属caps分子标记及其在品种鉴定中的应用。

背景技术：

1、朱顶红属(hippeastrum spp.)为石蒜科(amaryllidaceae)种球开花植物，花形奇特，具有极高的观赏价值。朱顶红起源于美洲亚热带地区，广泛分布于巴西东部、秘鲁、阿根廷和玻利维亚等国家或地区。该属的大多数物种及其杂交品种都有巨大、壮观的彩色花朵，具有很高的装饰、观赏价值。荷兰、美国、南非等国都进行了育种研究，培育出多个品种，用于切花、盆栽和园林观赏。迄今为止，育种家通过杂交育种等手段已经培育出600多个具有商业价值的品种，且逐年增加。如图1所示，朱顶红属植物的品种鉴定主要依靠花器官的特异性，而在非开花时期很难进行品种鉴定。随着培育的新品种数量增加，使得朱顶红的栽培品种、杂交后代和原种的鉴定变得更加困难。这也给朱顶红的种质资源收集与保护、商业品种交易与鉴定、品种权保护等工作带来很大的困难。

2、基于不同品种间的dna序列差异开发的分子标记是鉴定朱顶红品种的有效方法。相较于通过花器官性状鉴定，利用分子标记鉴定朱顶红品种既不受生长条件、生长时期的影响，同时又具有稳定性、可重复性。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。snp在全基因组中具有密度高、代表性强、遗传稳定性好的特点；snp标记是二等位基因，代表基因组中最小的遗传变异单元，数据统计简单、准确；snp的检测方法灵活多样，易实现自动化。snp-caps实质上是基于snp的pcr技术与限制性内切酶(restriction endonuclease，re)技术结合的分子标记技术，简单理解就是某snp恰好位于酶切位点上，通过对该snp位点设计引物，经pcr后获得的相应产物片段经酶切、电泳等步骤，最终通过观察不同的条带判断样本的多态性。目前没有合适用于鉴定朱顶红属的snp-caps分子标记，因此，亟需开发一种分子标记，能够快速、经济、稳定地对朱顶红属植物进行物种鉴定。

技术实现思路

1、本研究通过开发一套具有ecori酶切位点的snp-caps分子标记，依靠不同标记的酶切分子指纹图谱差异对朱顶红的品种进行鉴定，并制作每个品种特有的分子身份证。

2、本发明第一方面的目的，在于提供一种用于构建朱顶红品种分子身份证的snp分子标记。

3、本发明第二方面的目的，在于提供用于扩增本发明第一方面的snp分子标记的引物对。

4、本发明第三方面的目的，在于提供一种检测试剂、基因芯片或试剂盒。

5、本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的snp位点、本发明第二方面的引物对或本发明第三方面的检测试剂、基因芯片或试剂盒的应用。

6、本发明第五方面的目的，在于提供一种朱顶红品种分子身份证的构建方法。

7、本发明第六方面的目的，在于提供一种朱顶红品种分子身份证。

8、本发明第七方面的目的，在于提供一种朱顶红种质、品种鉴定方法。

9、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

10、本发明的第一个方面，提供一种用于构建朱顶红品种分子身份证的snp分子标记，所述snp分子标记包括hcaps1、hcaps16、hcaps20、hcaps27、hcaps49、hcaps92、hcaps93、hcaps106、hcaps114、hcaps117、hcaps136、hcaps137、hcaps139、hcaps148、hcaps152、hcaps156、hcaps178、hcaps185、hcaps198和hcaps203，其中，所述hcaps1位于seq id no:1所示序列的第312位碱基，碱基为t/a；所述hcaps16位于seq id no:2所示序列的第225位碱基，碱基为a/g；所述hcaps20位于seq id no:3所示序列的第306位碱基，碱基为a/g；所述hcaps27位于seq id no:4所示序列的第226位碱基，碱基为g/c；所述hcaps49位于seq idno:5所示序列的第259位碱基，碱基为g/a；所述hcaps92位于seq id no:6所示序列的第294位碱基，碱基为c/t；所述hcaps93位于seq id no:7所示序列的第223位碱基，碱基为g/a；所述hcaps106位于seq id no:8所示序列的第255位碱基，碱基为c/t；所述hcaps114位于seqid no:9所示序列的第392位碱基，碱基为t/a；所述hcaps117位于seq id no:10所示序列的第257位碱基，碱基为a/g；所述hcaps136位于seq id no:11所示序列的第317位碱基，碱基为g/a；所述hcaps137位于seq id no:12所示序列的第345位碱基，碱基为g/a；所述hcaps139位于seq id no:13所示序列的第222位碱基，碱基为c/t；所述hcaps148位于seqid no:14所示序列的第265位碱基，碱基为c/t；所述hcaps152位于seq id no:15所示序列的第331位碱基，碱基为a/g；所述hcaps156位于seq id no:16所示序列的第263位碱基，碱基为t/c；所述hcaps178位于seq id no:17所示序列的第260位碱基，碱基为g/a；所述hcaps185位于seq id no:18所示序列的第278位碱基，碱基为g/a；所述hcaps981位于seqid no:19所示序列的第211位碱基，碱基为t/c；所述hcaps203位于seq id no:20所示序列的第231位碱基，碱基为t/g。

11、本发明的第二个方面，提供用于扩增本发明第一方面的snp分子标记的引物对，所述引物对如seq id no:21～seq id no:60。

12、在本发明一些实施方式中，seq id no:21～seq id no:60按顺序每两个核酸序列构成一个引物对，分别依次对应hcaps1～hcaps203。利用本发明提供的引物对，制作分子标记，可以实现朱顶红分子身份证的快速构建。

13、本发明的第三个方面，提供包括本发明第二方面的引物对的检测试剂、基因芯片或试剂盒。

14、在本发明一些实施方式中，所述试剂盒还包含dntps、dna聚合酶、pcr反应缓冲液、限制性内切酶和标准阳性模板中的一种或多种。在本发明一些实施方式中，所述限制性内切酶为ecori内切酶。

15、本发明的第四个方面，提供本发明第一方面的snp位点、本发明第二方面的引物对或本发明第三方面的检测试剂、基因芯片或试剂盒在(1)～(6)中至少一种中的应用：(1)鉴定朱顶红品种；(2)制备鉴定朱顶红产品；(3)构建朱顶红品种分子身份证；(4)朱顶红种质亲缘关系鉴定；(5)朱顶红种质资源管理和开发利用；(6)朱顶红品种保护、评价。

16、本发明的第五个方面，提供一种朱顶红品种分子身份证的构建方法，包括使用本发明第二方面的引物对或本发明第三方面的检测试剂、基因芯片或试剂盒对待测样品检测本发明第一方面的snp分子标记的步骤。

17、在本发明一些实施方式中，所述构建方法包括以下步骤：1)采用本发明第二方面的引物对或本发明第三方面的检测试剂、基因芯片或试剂盒对待测样品的dna进行pcr扩增；2)分析pcr扩增产物的snp位点基因型，依据snp位点基因型将各分子标记数字化，按照hcaps1～hcaps203的顺序依次排列，串联成分子身份证编码。

18、在本发明一些实施方式中，所述分析pcr扩增产物的snp位点基因型包括对pcr扩增产物进行酶切再电泳；或，所述分析pcr扩增产物的snp位点基因型对所述pcr扩增产物进行测序。

19、在本发明一些实施方式中，采用限制性内切酶酶切pcr扩增产物后，对酶切产物进行特征条带的电泳检测，判断所述snp位点基因型，根据基因型将a、t、c、g依次转换为1、2、3、4，缺失位点转换为0，按照hcaps1～hcaps203的顺序依次排列，串联成分子身份证编码。

20、本领域技术人员应该理解，分析snp位点碱基类型的方法有很多，包括测序分析、等位基因特异性pcr分析、酶切产物多态性分析等。

21、在本发明一些实施方式中，将种质资源类别(身份证第一位数字，如，1代表野生资源(群体)、2代表野生资源(家系)、3代表野生资源(无性系)、4代表地方品种、5代表选育品种、6代表选育品系、7代表遗传资料)、资源来源区号(身份证第二至五位，如0031代表原产地为荷兰)进行数字化，置于在分子身份证编码(身份证第六至四十五位)之前，形成45位分子身份证编号。

22、在本发明一些实施方式中，所述限制性内切酶为ecori内切酶。

23、在本发明一些实施方式中，所述pcr反应体系包括：待测样本dna 2～3ng/μl，上游引物0.2～0.3μm，下游引物0.2～0.3μm，0.3～0.7μl/μl 2×taq pcr starmix，其余为水。

24、在本发明一些实施方式中，所述pcr反应条件为：第一阶段94～96℃预变性4～6min；第二阶段93～95℃变性18～22s，53～55℃退火18～22s，71～73℃延伸28～32s，36～42个循环；第三阶段71～73℃再延伸4～6min。

25、在本发明一些实施方式中，所述酶切反应体系包括：pcr扩增产物5～15μl/μl，ecori内切酶0.05～0.1μl/μl，buffer 0.5～1.5μl/μl。

26、在本发明一些实施方式中，所述酶切反应条件为：33～40℃，2～4h。

27、本发明的第六个方面，提供一种朱顶红品种分子身份证，由本发明第五方面的构建方法构建得到。

28、在本发明一些实施方式中，所述朱顶红品种分子身份证还包括如下信息：种质资源类别、资源来源区号和/或种质资源信息。

29、在本发明一些实施方式中，所述朱顶红品种分子身份证的呈现形式包括条形码和/或二维码。

30、本发明的第七个方面，提供一种朱顶红种质、品种鉴定方法，利用本发明第六方面的朱顶红品种分子身份证的唯一性确定对应的朱顶红所属种质或品种。

31、本发明的有益效果是：

32、本发明提供了一组可用于构建朱顶红品种分子身份证的snp分子标记，能够在分子水平对朱顶红做出精准鉴定，理论上根据该20个snp位点可鉴定共有320＝3,486,784,401种基因型，可满足复杂多样朱顶红种质资源的身份鉴定。

33、本发明开发的基于snp分子标记的朱顶红分子身份证，能够实现对不同朱顶红种质身份和亲缘关系的鉴定，为朱顶红种质资源管理和开发利用、品种保护及评价提供技术支持。