本发明涉及pcr检测，尤其涉及乳头瘤病毒dna多重pcr检测的引物探针组、试剂盒及检测方法。
背景技术：
1、目前已经明确高危型人乳头瘤病毒持续感染是宫颈癌及癌前病变发生的必要因素，尤其是hpv16型和18型和宫颈癌关系最为密切。高危型人乳头瘤病毒检测也被纳入宫颈癌诊疗指南，作为宫颈癌早期筛查的重要手段之一。高危型hpv检测的常用方法包括荧光pcr法、反向点杂交法、基因测序法、pcr-溶解曲线法、基因芯片法等。
2、荧光pcr技术是目前分子诊断领域应用最广泛的一种检测技术，因其检测灵敏度高、特异性强而被广泛应用于病原体检测、肿瘤早筛、食品检测等诸多领域。其核心原理为pcr扩增和荧光信号检测，其中pcr扩增过程模拟了生物体内dna半保留复制过程，在生物酶、dntps、金属离子等物质存在的条件下，以与靶基因核酸序列互补配对的引物为向导合成新的核酸片段，其反应条件包括变性、退火和延伸三个过程。荧光信号通过在一段与靶标序列互补且5’端和3’端分别标记报告基团和淬灭基团的探针来实现检测。常见的探针包括最常用的taqman探针、分子信标探针、蝎型探针、mgb探针等，不同类型的探针应用的具体检测领域不一样。
3、目前已上市的高危型hpv检测产品大多数都是基于荧光pcr法的检测原理，对hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型共14种高危型进行全分型或部分分型(一般为16型和18型区分检测，其他分型不区分)检测。其检测流程主要包括：a)临床宫颈样本(宫颈脱落细胞)的采集；b)宫颈样本的核酸提取，以获取hpv病毒的核酸；c)荧光pcr检测。
4、但在临床实践中存在以下几点问题：a)采用宫颈样本作为检测样本类型，采集方式具备“侵入性”，用户体验感较差，是诸多女性不愿意接受宫颈癌hpv筛查的最主要原因；b)检测时间过长，尤其是pcr检测过程，常规用时在1.5～2小时左右，筛查效率低；c)试剂操作复杂，pcr检测前需人工将多个试剂组分混合配制。
技术实现思路
1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，而提出的乳头瘤病毒dna多重pcr检测的引物探针组、试剂盒及检测方法。
2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
3、一种高危型人乳头瘤病毒dna多重pcr检测的引物探针组，包括：
4、靶标hpv16，包括：
5、上游引物5’-ccaccttccagcagatgttgactctacgcttcggttgt-3’；
6、下游引物5’-ccaccttccagcagatgttgcccattaacaggtcttcc-3’；
7、探针5’-cgtacaaagcacacacgtagacattcg-3’；
8、靶标hpv18，包括：
9、上游引物5’-ccaccttccagcagatgttcacaacatagctgggcact-3’；
10、下游引物5’-ccaccttccagcagatgtgttggagtcgttcctgtcgt-3’；
11、探针5’-aggccagtgccattcgtgctgc-3’；
12、靶标hpv31，包括：
13、上游引物5’-ccaccttccagcagatgtcctcgtactgaaacccaagtg-3’；
14、下游引物5’-ccaccttccagcagatgtgctgtcgggtaattgctcat-3’；
15、探针5’-tgcgtggagaaacacctacgttgc-3’；
16、靶标hpv33，包括：
17、上游引物5’-ccaccttccagcagatgttcaagacactgaggaaaaacca-3’；
18、下游引物5’-ccaccttccagcagatgtttgcattccacgcactgtag-3’；探针5’-cgaacattgcatgatttgtgcca-3’；
19、靶标hpv35，包括：
20、上游引物5’-ccaccttccagcagatgtaaaaaccgctgtgtccagtt-3’；下游引物5’-ccaccttccagcagatgtgacatacaccgacctgtcca-3’；探针5’-cgattccataacatcggtggacgg-3’；
21、靶标hpv39，包括：
22、上游引物5’-ccaccttccagcagatgtgccggttgaccttgtatgtc-3’；下游引物5’-ccaccttccagcagatgtgttcatcccgtctggctagt-3’；探针5’-cccgaccatgcagttaatcacca-3’；
23、靶标hpv45，包括：
24、上游引物5’-ccaccttccagcagatgtaggaggaaaacgatgaagca-3’；下游引物5’-ccaccttccagcagatgtaagctcaattctgccgtcac-3’；探针5’-cgagccgaaccacagcgtca-3’；
25、靶标hpv51，包括：
26、上游引物5’-ccaccttccagcagatgttatgcgtgaccagctaccag-3’；下游引物5’-ccaccttccagcagatgtacttgaacacctgcaacacg-3’；探针5’-cgggctggacaggctacgtg-3’；
27、靶标hpv52，包括：
28、上游引物5’-ccaccttccagcagatgtattatgggtcgttggacagg-3’；下游引物5’-ccaccttccagcagatgtcgttacacttgggtcacagg-3’；探针5’-tgttcagagtgttggagaccccga-3’；
29、靶标hpv56，包括：
30、上游引物5’-ccaccttccagcagatgttgagtgtaagtttgtggtgcag-3’；下游引物5’-ccaccttccagcagatgtcagagtgggcacgttactgt-3’；探针5’-tggacattcacagtaccaaagaggacc-3’；
31、靶标hpv58，包括：
32、上游引物5’-ccaccttccagcagatgtatatttcgggtcgttggaca-3’；
33、下游引物5’-ccaccttccagcagatgttagcgttgggttgtttcctc-3’；
34、探针5’-tccaacacactgcacagcgcc-3’；
35、靶标hpv59，包括：
36、上游引物5’-ccaccttccagcagatgtatggcacgctttgaggat-3’；
37、下游引物5’-ccaccttccagcagatgttgcgaatatcatgcagagga-3’；
38、探针5’-cacaacgaccatacaaactgcctga-3’；
39、靶标hpv66，包括：
40、上游引物5’-ccaccttccagcagatgttcagtgtatggggcaacatt-3’；
41、下游引物5’-ccaccttccagcagatgtattgtttttcctccggtgtt-3’；
42、探针5’-aggtgctaccgatgtcaatgtccg-3’；
43、靶标hpv68，包括：
44、上游引物5’-ccaccttccagcagatgtccgtgcaggaaattgtgtta-3’；
45、下游引物5’-ccaccttccagcagatgtgcatggtcgggttcatctat-3’；
46、探针5’-tcacgagcaattaggagattcagacga-3’；
47、通用引物，ccaccttccagcagatgt-3’；
48、内标，包括：
49、上游引物5’-ctcttccagccttccttcct-3’；
50、下游引物5’-tgttggcgtacaggtctttg-3’；
51、探针5’-catgaagtgtgacgtggacatccg-3’。
52、一种高危型人乳头瘤病毒dna多重pcr检测的试剂盒，采用引物探针组，包括pcr混合液、阴性对照品、阳性对照品；
53、其中pcr混合液包括引物探针组。
54、优选地，所述hpv引物的终浓度为0.05～0.2μm，hpv探针的终浓度为0.1～0.4μm，内标引物和探针的终浓度分别为0.2～0.8μm、0.1～0.4μm，通用引物的终浓度为0.2～0.8μm。
55、优选地，所述pcr混合液还包括pcr mix，主要成分包括快速taq酶、udg酶、dntps、buffer。
56、优选地，所述阴性对照品为含人基因组dna的生理盐水，阳性对照品为含人基因组dna、hpv16型质粒、hpv18型质粒和hpv31型质粒的生理盐水。
57、优选地，所述hpv16型探针5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq2淬灭基团；hpv18型探针5’端标记cy5荧光基团，3’端标记bhq3淬灭基团；hpv31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型探针5’端均标记fam荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团；内标探针5’端均标记vic荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团。
58、一种高危型人乳头瘤病毒dna多重pcr检测的检测方法，采用一种高危型人乳头瘤病毒dna多重pcr检测的试剂盒，包括以下步骤：
59、a)将采集的待测初段尿液样本进行离心处理，弃除部分上清，保留200～500μl液体后重悬；
60、b)使用核酸提取试剂提取处理后的尿液样本以及试剂盒内的阴性对照品、阳性对照品的dna作为核酸模板备用；
61、c)取试剂盒内的pcr混合液分装至pcr反应管中；
62、d)吸取提取好的尿液样本、阴性对照品、阳性对照品的核酸模板分别加入到分装有pcr预混液的pcr反应管中，混匀离心；
63、e)在荧光定量pcr仪进行荧光pcr检测；
64、f)pcr扩增结束后，使用荧光pcr仪的分析软件对待测样本、阴性对照品、阳性对照品的结果进行分析，通过fam/vic/rox/cy5通道的荧光信号值来判定实验有效性和样本的高危型hpv感染情况。
65、优选地，将采集的待测初段尿液样本进行3000rpm离心20分钟处理，弃除部分上清，保留200～500μl液体后重悬。
66、优选地，所述荧光pcr检测的反应程序为：1)98℃1min；2)98℃1～3s，60～62℃5～15s，5个循环；3)98℃1～3s，58℃5～15s，35个循环。
67、优选地，所述c)中，取10μl试剂盒内的pcr混合液分装至pcr反应管中；d)中，吸取提取好的尿液样本、阴性对照品、阳性对照品的核酸模板各10μl分别加入到分装有pcr预混液的pcr反应管中，混匀离心。
68、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
69、1)本发明以女性初段尿液作为检测样本，相比于宫颈样本，采样更方便，体验感更好，能够提供女性的宫颈癌筛查意愿；同时，使用初段尿也提高尿液中宫颈脱落细胞的含量，配合提供的细胞富集方法，能显著的提高临床hpv检测的临床灵敏度。
70、2)本发明采用性能更好、扩增效率更高的的pcr mix(含快速taq酶)作为核心原料，极大的缩短了pcr的检测时间，同时pcr mix中特殊的组分能够减少尿液样本中残留的杂质对pcr的抑制效果；
71、3)与常规试剂盒使用的引物探针不同，本发明的引物探针组中引物为特殊设计的引物，在hpv特异性引物的5’端引入了一段共同的标签序列，这样可以减少各hpv分型特异性引物的浓度使其仅需在第一阶段的5个pcr循环中被使用消耗，由于第一阶段的pcr产物引入了标签序列，第二阶段的扩增仅需一套与标签序列相同的通用引物即可完成剩余35个循环的扩增检测，该方法的优势是降低了由于引物探针过多容易产生引物二聚体的风险或扩增过程引物间的相互干扰效应，从而提高检测的灵敏度和特异性。
72、4)与常规的试剂盒不同，本发明将引物探针、taq酶、pcr buffer等pcr必需成分组合到一个pcr混合液组分中，在保证检测性能和试剂稳定性的前提下，简化了临床操作流程。