一种发根农杆菌介导的尾巨桉遗传转化方法及其应用与流程

本发明属于遗传转化，具体涉及一种发根农杆菌介导的尾巨桉遗传转化方法及其应用。

背景技术：

1、桉树(eucalyptus)是桃金娘科(myrtaceae)桉属(eucalyptus)、伞房属(corymbia)和杯果木属(angophora)植物的总称。桉树的木材质量优良，是建筑业、家具制造业以及造纸业的主要原料，为我国木材安全保障以及生态文明建设做出了巨大的贡献。尾巨桉(eucalyptus urophylla×e.grandis)是尾叶桉(e.urophylla)与巨桉(e.grandis)的杂交种，具有明显的杂种优势，其干形均匀通直、轮伐周期短以及出材率高，是我国桉树人工林的主栽品种。随着我国木材加工业的快速发展，全社会对木材资源的需求量也在随之增加，有限的资源导致供需不平衡，为满足全社会对桉树资源日益增长的需求，研究人员将不断培育速生、优质、高产的桉树品种作为科研工作的首要目标。

2、传统育种方法主要包括选择、杂交以及多倍体育种等，而这些育种手段往往存在着育种周期长、改良成功率较低、优良性状难以稳定遗传以及控制精度差等局限性，因此难以满足快速定向培育桉树新品种的要求。上世纪八十年代，parson等首次通过基因工程技术将外源基因转入杨树(populus l.)中进行表达，成功的获得了抗除草剂的杨树，从此揭开了林木基因工程的序幕。相对于传统育种来说，转基因技术不仅可以避开物种间杂交不育的生殖隔离等局限性，进行基因交流从而实现外源优良基因的稳定表达，而且还能够保持原品种或品系的优良性状。近年来，随着基因组学和分子生物学的蓬勃发展，基因工程在林木品种改良优化以及加快遗传育种进程方面越来越受到重视，具有巨大的应用前景。目前桉树的基因工程主要集中在抗病抗虫基因工程、抗逆基因工程、抗除草剂基因工程以及木材品质改良基因工程等方面。

3、植物的转基因技术主要包括农杆菌介导法、基因枪法、聚乙二醇介导法、花粉管通道法以及电激法等。其中农杆菌介导法因操作简易、成本低廉、拷贝数低、基因沉默现象少以及能转化较大片段dna等优点而被广泛应用。农杆菌介导法共分为根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)介导法和发根农杆菌(agrobacterium rhizogenes)介导法，它们分别含有致瘤ti质粒和致根ri质粒，寄主范围较为广泛。在自然条件下农杆菌通过浸染植物的受伤部位进入植物细胞，并将其ti质粒或ri质粒上的t-dna片段插入到植物的基因组中，从而实现外源基因向宿主植物细胞的转移和整合，然后通过成熟的植物组织培养技术，最终得到完整的转基因植物，因而被誉为天然高效的转基因载体。然而利用根癌农杆菌介导法转化植物从而获得转基因植株的前提是需要建立高效的再生体系，这也是目前仅有少量植物能够进行转基因育种的主要原因。林木类尤其是桉树杂合度高，不同品种和无性系遗传背景不同，同时具有大量的次生代谢物，因此建立高效的再生体系存在着一定的难度，导致难以建立桉树的遗传转化体系，进而影响了功能基因的鉴定和转基因育种的开展。目前在桉树中关于发根农杆菌介导的毛状根转化体系少有报道，且由于不同的桉树品种和无性系遗传背景不一致，导致遗传方法也有所差异，而对于我国华南地区广泛种植的栽培品种尾巨桉的遗传转化体系国内还未见报道。因此，建立一个高效稳定的发根农杆菌介导的尾巨桉遗传转化体系可为进一步开展桉树木质素合成、次生代谢产物合成等相关基因功能的鉴定提供了一个有力的工具。

技术实现思路

1、本研究旨在利用植物的转基因技术，建立一个简单快速、高效稳定的发根农杆菌介导的尾巨桉遗传转化体系，可以在较短的时间内实现根的稳定转化，通过优化转化体系中的主要影响因子来进一步提高转化效率，从而获得更多的转基因植株，为后期开展基因功能的研究提供稳定的实验材料。同时，初步探索基于桉树毛状根的不定芽的诱导实验，为后期培育桉树新品种提供一条新的途径与方法。

2、本发明的目的是提供一种发根农杆菌介导的尾巨桉遗传转化方法，包括以下步骤：

3、s1.取在增殖培养基中培养20-25d的增殖苗叶片作为外植体，将表面划有1-2道伤口的增殖苗叶片外植体置于od600＝0.3的msu440发根农杆菌悬浮液中浸染30min；

4、所述的浸染为浸泡结合超声波辅助处理5s，浸泡期间每隔5min震荡一次；

5、s2.浸染结束后，用无菌滤纸吸干外植体表面的悬浮液，随后置于共培养培养基上并在黑暗条件下共培养3d；

6、所述的共培养培养基的组成如下：20.0g/l蔗糖、6.0g/l琼脂粉、50μm as，余量为wpm；

7、s3.将共培养结束后的外植体转入毛状根诱导培养基培养2-4个星期，获得毛状根；

8、所述的毛状根诱导培养基的组成如下：20.0g/l蔗糖、2.5mg/l pvp、2.0g/l pvpp、0.8g/l水解酪蛋白、200mg/l cef、6.0g/l琼脂粉，余量为wpm；

9、s4.将毛状根切成小段，接种至芽诱导培养基中培养至长出绿色小芽点后，再将绿色小芽点转入增殖培养基进行增殖培养；

10、所述的芽诱导培养基的组成如下：0.2mg/l tdz、0.2-0.5mg/l iba、20.0g/l蔗糖、6.0g/l琼脂粉，余量为wpm；

11、s5.待绿色小芽点长至2-3cm，转入生根培养基进行生根培养，获得生根苗。

12、优选，所述的增殖培养基的组成如下：0.5mg/l 6-ba、0.1mg/l naa、20.0g/l蔗糖、6.0g/l琼脂粉，余量为ms培养基。

13、优选，所述的增殖苗为生长健壮、高度超过2cm的芽苗。

14、优选，所述的超声波的频率为50hz。

15、优选，所述的培养的条件为光照时间16h/d、光照强度100μmol/m2·s、培养温度25±2℃。

16、优选，所述的芽诱导培养基的组成还可以如下：0.2mg/l tdz、0.1mg/l iaa，余量为wpm。

17、优选，所述的将毛状根切成小段为将毛状根切成长度为0.5-1.0cm的小段。

18、优选，所述的生根培养基的组成如下：0.5mg/l iba、20g/l蔗糖、6g/l卡拉胶，余量为1/2ms。

19、本发明的有益效果：

20、本发明以华南地区广泛种植的尾巨桉优良无性系dh32-29为外植体材料，建立一个简单快速、高效稳定的发根农杆菌介导的尾巨桉遗传转化体系，可以在相对较短的时间内实现根的稳定转化，并通过优化转化体系过程中的相关因素来提高转化效率，从而获得更多的转基因植株，为今后开展桉树特定基因(如木质素合成中相关基因等)功能的鉴定提供一种新的途径和方法，同时也为桉树的遗传改良和新品种的培育奠定基础。

21、利用本发明建立的体系成功地获得了少量再生植株，为基于尾巨桉毛状根诱导转基因再生植株带来了希望，为快速培育转基因植株提供了一条新的途径和方法，同时也为其他非模式树种提供了新的思路。