一种微流控装置及其应用

本发明涉及基础医学领域，具体涉及一种微流控装置及其应用。

背景技术：

1、与传统的二维(2d)培养系统相比，三维(3d)肿瘤球模型能更真实的体现体内肿瘤生理特征和复杂性。肿瘤球(tumor spheroids)包含了基本的空间梯度分布特征，这也是实体瘤的基本标志之一。这种空间特性是由血管通透性和肿瘤细胞强大的增殖能力之间复杂的相互作用形成的，导致了从血管近端到远端区域的梯度环境。梯度微环境的重要性已被认为在肿瘤发生、侵袭、转移和耐药性获得的复杂过程中发挥着关键作用。同样，随着球体的生长，与外部微环境的距离增加，导致化学梯度(ph、氧、葡萄糖、atp分布、乳酸积累等)的建立，从而阻碍了肿瘤细胞在内部空间的代谢活动。同时，具有不同增殖能力的不同区域出现，将肿瘤球分为外周增殖层(peripheral proliferating layer)、中间静止层(intermediate quiescent layer)和内部坏死核心(inner necrotic core)。得益于肿瘤球与实体瘤的显著相似性，基于肿瘤球模型所取得的研究进展极大地增强了我们对肿瘤生物学的理解，并为治疗进步做出了贡献。

2、但是，传统的肿瘤球模型表现出两个固有的不足，大小和形状。研究表明，随着肿瘤球的生长，由细胞生长和增殖引起的固体应力对其生长施加了限制，其直径上限估计为1000μm左右。在这种尺度下，下游分析(如石蜡包埋和切片制备)变得具有挑战性，特别是从不同增殖区域提取细胞进行分子机制分析变得极其困难。第二点挑战是肿瘤球的球形结构，除了使用光学显微镜做光学切片观察，传统的倒置荧光显微镜很难获取尤其是实时监测肿瘤球的内部特征。

3、微流控技术(microfluidic technology)的进步解决了传统肿瘤球模型面临的几个挑战。有研究报道开发了不同的微流控装置，主要利用基于流动的或基于扩散的策略来模拟和控制肿瘤球或实体瘤的梯度特性(如氧、ph、细胞活力等)。而且绝大多数微流控平台采用透明基板，简化了对不同微环境区域的实时观察。然而，尚未报道可以建立类似肿瘤球梯度空间分布特征的装置，尤其是实现从外周层到内核的径向分布，并随后允许提取不同区域的细胞成分用于下游的分子机制分析，如组织学染色和qpcr分析或测序。

技术实现思路

1、为了解决以上技术问题，我们开发了一种新型的微流控装置(以下在实施例中也称为装置或芯片)，能够有效地将三维肿瘤球特征投影到二维平面上，且不需要复杂的管道系统。该装置有助于形成具有不同层的球形微环境：外周增殖层(peripheralproliferating layer)、中间静止层(intermediate quiescent layer)和内坏死核心(inner necrotic core)。通过本技术的微流控装置可以有效建立连续的ph、氧和硬度(stiffness)梯度，复制出在肿瘤球(tumor spheroids)中观察到的经典梯度层分布。

2、该装置以三个环形微柱阵列为特征，旨在将细胞和甲基丙烯酸明胶(gelma)的混合物限制在中心区域。这种设计复制了形成肿瘤球形微环境所需的条件，允许营养物质和氧气从外围扩散到内核。在芯片上建立细胞增殖状态、ph值、氧水平和硬度特征的梯度分布。

3、在体外培养后，肿瘤细胞与gelma的混合物已经完全融合在一起，本技术中称为“细胞聚集体”。该装置上的细胞聚集体可以很容易地释放，可以轻松地从不同梯度区域检索细胞进行下游分子分析。与现有的方法相比，该本技术的微流控装置对肿瘤球微环境的复制更加友好、全面，具有良好的可扩展性。可作为研究与肿瘤生物学研究相关的梯度环境的多功能工具，包括趋化效应、细胞-细胞相互作用、耐药机制和免疫浸润。

4、具体地，本技术提供了以下技术方案：

5、第一方面，本发明提供了一种微流控装置，所述装置具有基板和封盖层，所述封盖层上具有凹陷区域，凹陷区域中具有三层呈同心圆形状排列的微柱，所述微柱的高度与凹陷区域的深度相同，同心圆中最大圆形的直径是1000-10000μm，同层的微柱之间的距离是100μm，不同层之间间隔100μm，所述同心圆的圆心位置具有贯穿封盖层的穿孔。

6、优选地，所述凹陷区域的深度为100-1000μm，具体包括100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm。

7、最优选地，所述凹陷区域的深度为300μm，微柱的高度也为300μm。

8、优选地，同心圆中最大圆形的直径包括1000μm、2000μm、3000μm、4000μm、5000μm、6000μm、7000μm、8000μm、9000μm、10000μm。

9、最优选地，同心圆中最大圆形的直径是6000μm。

10、优选地，所述微柱横截面的长度为100μm、宽度为50μm。其中，垂直于圆半径的边长称为长度，平行于称为圆半径的边长称为宽度。

11、优选地，同心圆所包围的区域中还可以设计高度为300μm的一个或多个柱体，用于维持空间结构。在本发明具体实施例中设置12个柱体进行实验验证。

12、优选地，所述穿孔的直径是1mm。

13、优选地，所述凹陷区域呈任意形状。

14、优选地，所述凹陷区域呈圆形。

15、更优选地，所述凹陷区域的圆心与三层呈同心圆形状排列的微柱的圆心位置相同。

16、更优选地，所述凹陷区域的直径根据同心圆中最大圆形的直径调整，当同心圆中最大圆形的直径是6000μm时，优选凹陷区域的直径是12mm。

17、优选地，所述封盖层上有一个或多个孔洞，所述孔洞与凹陷区域相连接。

18、优选地，所述孔洞可以是任意形状，优选圆形(近似圆形，与凹陷区域重叠的区域形成缺口)。

19、优选地，所述封盖层的厚度大于凹陷区域的深度。

20、优选地，所述基板的直径为34毫米，从而可以放置于常规6孔板中兼容适配，从而批量操作。

21、优选地，所述基板是透明的。

22、优选地，所述基板材质可以是硅、玻璃、陶瓷。

23、优选地，所述基板的材质是玻璃。

24、优选地，所述封盖层的材质选自聚二甲基硅氧烷(pdms)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚碳酸酯(pc)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚四氟乙烯(ptfe)、聚氯乙烯(pvc)、环状聚烯烃共聚合物(cyclic olefin copolymers，coc)、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚砜、尼龙、苯乙烯-丙烯酸共聚物、天然橡胶、聚异戊二烯、丁基橡胶、卤化丁基橡胶、聚丁二烯、丁苯橡胶、丁腈橡胶、氯丁二烯橡胶、乙丙橡胶、表氯醇橡胶、聚丙烯酸酯橡胶、硅酮橡胶、氟硅橡胶、含氟弹性体(fkm)、全氟弹性体(ffkm)、乙烯-乙酸乙烯酯、节肢弹性蛋白(resilin)、弹性蛋白(elastin)、聚酰亚胺、酚醛树脂中的一种或者任意两种以上的混合物。

25、优选地，所述封盖层的材质选自聚二甲基硅氧烷(pdms)。

26、具体地，使用时，所述封盖层置于基板上，凹陷区域与基板形成空腔(中央细胞室)，由穿孔(细胞加载入口)加载含有细胞的混合物cell-gelma，封盖层的三层同心圆结构排列的微柱可以防止细胞渗透流失；孔洞中添加细胞培养基，细胞培养基可以渗透进入空腔并为细胞培养提供细胞生长所需成分，形成近似于肿瘤球的梯度特征，包括ph值、缺氧和硬度的梯度特征。

27、另一方面，本发明提供了以上微流控装置在模拟肿瘤球中梯度微环境中的应用。

28、另一方面，本发明提供了一种在2d平面模拟肿瘤球中梯度微环境的方法，所述方法包括将前述微流控装置的基板和封盖层组装，将细胞与gelma的混合物由封盖层上的穿孔加入到基板和封盖层形成的空腔中，并向封盖层的孔洞中添加细胞培养基，添加混合物和细胞培养基后置于标准细胞培养条件中，定时更换培养基。

29、优选地，所述混合物覆盖(填满)空腔。

30、优选地，混合物加入到空腔中后，使用薄片覆盖(封闭)穿孔。具体可以是9毫米的盖玻片。

31、优选地，所述混合物中细胞数量小于1×106细胞/10μl gelma。

32、优选地，所述混合物中gelma和细胞的用量比例可以是1-10×105细胞/10μlgelma，具体包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10×105细胞/10μl gelma。

33、优选地，所述标准细胞培养条件具体例如37℃、5％ co2的加湿培养箱中培养。

34、优选地，所述微流控装置置于含有少量水(无菌水)的容器中，防止过度蒸发。具体可以是置于6孔板中，6孔板孔外的缝隙需要用无菌水填满。

35、优选地，更换培养基的频次及培养总时长可以根据细胞特性及生长状态确定，具体例如每两天换液，共计培养1-10或更多天。

36、优选地，所述细胞包括来源于人、猩猩、猴、马、牛、羊、猪、驴、骆驼、狗、兔、猫、大鼠、小鼠、鱼、鸟或昆虫的任意细胞。

37、优选地，所述细胞包括原代细胞、组织来源干细胞、组织来源前体细胞、诱导多能干细胞、分化来源细胞、转分化来源细胞、细胞工程获得的细胞、肿瘤干细胞、肿瘤组织分离的肿瘤细胞、肿瘤相关成纤维细胞、基质细胞、免疫细胞、细胞株、细胞系、昆虫细胞、细胞团块、组织团块、体外培养器官中的一种或多种

38、优选地，所述培养基可以是任意适配于目标细胞的培养基。例如dmem/f12细胞培养基、william’s e细胞培养基、neurobasal medium细胞培养基、mem细胞培养基、dmem细胞培养基、1640rpmi细胞培养基，或f12细胞培养基等中的一种或两种以上。

39、另一方面，本发明提供了一种制备具有梯度微环境的细胞切片的方法，所述方法包括将细胞培养的步骤和固定的步骤，

40、所述细胞培养的步骤是：将前述微流控装置的基板和封盖层组装，将细胞与gelma的混合物由封盖层上的穿孔加入到基板和封盖层形成的空腔中，并向封盖层的孔洞中添加细胞培养基，添加混合物和细胞培养基后置于标准细胞培养条件中，定时更换培养基；

41、所述固定的步骤是：将基板和封盖层拆分，向基板上残留的细胞上添加固定液固定。

42、优选地，所述切片可被分割，从而对其中特定区域的细胞进行针对性观察、检测。

43、优选地，所述固定液包括4％多聚甲醛。

44、优选地，所述细胞切片可用于常规的检测，如h&e染色、荧光染色、pcr检测等。

45、另一方面，本发明提供了以上方法制备得到的细胞切片。

46、优选地，所述细胞切片中细胞特性梯度分布，所述细胞特性包括增殖状态、ph值、氧水平和硬度特征等。