修饰的核苷酸单体及其用途的制作方法

本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种修饰的核苷酸单体及其在sirna分子中的用途。

背景技术：

1、近年来，在sirna成药方面取得了相当程度的进展。sirna作为药物活性成分已为公众所知，rna干扰其对应的sirna作用机制是以一种核酸内切酶复合物为特征介导的rna干扰方式。从基因水平上，通过sirna几乎可以治疗所有的疾病，包括肿瘤、传染病、遗传性疾病等，因而sirna已成为最热门的生物医药研究领域。理论上，sirna疗法可以靶向任何致病基因组中的靶基因，有着强力和持久的作用疗效，可以显著降低给药频率，提高患者用药的依从性，从而达到更好的治疗效果。

2、但是，sirna疗法并没有很快在临床中得到快速开发，其在体内的稳定性和十分有限的生物利用度成为寡聚核酸类新药开发的主要障碍。

3、为了综合改善sirna的活性、体内稳定性和药代动力学性能，提高其生物利用度，本领域技术人员经常会选择对sirna中特定的核苷酸进行化学修饰，改善sirna的理化性质，提高其在体内的生物利用度，来提高sirna对靶基因mrna的沉默效率。

4、本发明通过药物化学手段，合成经修饰后的核苷酸单体，并引入到sirna的特殊位置-反义链5’-端第一个位置，提高了sirna的药效。因此，本发明对sirna药物的开发具有十分重要的价值。本发明通过药物化学手段，合成经修饰后的核苷酸单体，并通过磷酸二酯键链接方式引入到sirna反义链5’-端第一个位置，这种对sirna序列的修饰，能够提高sirna靶基因的沉默效应。因此，本发明对sirna药物的开发和临床应用具有十分重要的价值。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明旨在提供一种新型修饰核苷酸，能够提高rnai药物分子对靶基因沉默的沉默效果。

2、一方面，本发明提供了一种具有式i所示结构的核苷酸单体化合物，或其立体异构体、或其氘代化合物、或其氟代化合物、或其可用的盐：

3、

4、其中，

5、表示单键或双键；

6、---表示单键存在或不存在；

7、m、w分别独立选自cr’、n、o、s或se；

8、r’选自氢、卤素、烷基或卤素取代的烷基；

9、x、x’分别独立选自o、nh、s、se或ch2；

10、每个pg’分别独立选自氨基或者羟基的保护基团；优选地，pg’为烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、芳香基、芳香基羰基、芳香烷氧基羰基；

11、r1、r2分别独立选自氢、卤素、烷基或卤素取代的烷基；

12、z为磷酸酯部分、硫代磷酸酯部分或亚磷酰胺部分；

13、y选自氢、卤素、叠氮基、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、-o-(c1-c6亚烷基)-o-(c1-c6烷基)、-o-(c1-c6亚烷基)-c(o)nry1ry2；

14、ry1、ry2分别独立选自氢、c1-c6烷基、环烷基；

15、bx为杂环碱基。

16、一方面，式i所示的化合物，所述bx选自a、t、u、g,、c以及其类似物，具有下列结构：

17、

18、

19、其中，r、r0选自氢、c1-c6烷基、c3-c6环烷基。

20、另一方面，式i所示的化合物，所述bx选自下列结构：

21、

22、一方面，式i所示的化合物，

23、y为甲氧基或者甲氧基乙基；

24、z为一方面，式i所示的化合物具体为：

25、

26、

27、其中，cep为

28、pg’为氨基或者羟基的保护基团；优选地，pg’为烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、芳香基、芳香基羰基、芳香烷氧基羰基。

29、另一方面，本发明还提供了式i所述的核苷酸单体化合物在制备寡核苷酸中作为中间体的用途；优选地，所述寡核苷酸为sirna。

30、本发明还提供了式i所述的核苷酸单体化合物作为中间体在制备sirna反义链的用途；优选地，提供了上述的核苷酸单体化合物作为中间体在制备sirna反义链5’端第一个核苷酸的用途。

31、本发明所述的sirna，其包含正义链和反义链；所述正义链和反义链各自包含15至45个修饰或未修饰的核苷酸，正义链和反义链部分互补形成双链区；其中，所述反义链5’端第一个核苷酸具有式ii所示的结构，并在位点与sirna其余部分共价连接：

32、

33、其中，表示单键或双键；

34、---表示单键存在或不存在；

35、m、w分别独立选自cr’、n、o、s或se；

36、r’选自氢、卤素、烷基或卤素取代的烷基；

37、x、x’分别独立选自o、nh、s、se或ch2；

38、每个pg’分别独立选自氢、氨基或者羟基的保护基团；优选地，pg’为烷基、烷基羰基、烷氧基羰基、芳香基、芳香基羰基、芳香烷氧基羰基；

39、r1、r2分别独立选自氢、卤素、烷基或卤素取代的烷基；

40、y选自氢、卤素、叠氮基、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、-o-(c1-c6亚烷基)-o-(c1-c6烷基)、-o-(c1-c6亚烷基)-c(o)nry1ry2；

41、ry1、ry2分别独立选自氢、c1-c6烷基、环烷基；

42、bx为杂环碱基。

43、本发明所述的sirna，所述bx选自a、t、u、g,、c以及其类似物，具有下列结构：

44、

45、

46、其中，r、r0选自氢、c1-c6烷基、c3-c6环烷基。本发明所述的sirna，所述bx选自下列结构：

47、本发明所述的sirna中式ii所示结构具体为：

48、

49、

50、本发明还提供了一种药物组合物，包含任一上述的sirna以及药学上可接受的载体。

51、本发明还提供了一种sirna缀合物，由任一上述的sirna和缀合分子缀合而成。

52、本发明还提供了一种试剂盒，包含任一上述的sirna、和/或上述的药物组合物和/或上述的sirna缀合物。

53、本发明还提供了任一上述的sirna,、和/或上述的药物组合物、和/或上述的sirna缀合物、和/或上述的试剂盒在制备药物中的用途。

54、另一方面，本发明还提供了一种抑制细胞中目标基因表达水平的方法，所述方法包括将有效量的本发明的sirna、药物组合物和/或sirna缀合物与所述细胞接触。

55、本发明的修饰核苷酸能够提高rnai药物分子对靶基因沉默的效果，能提升sirna的成药性，从而可以更加有效地治疗因靶基因mrna引起的相关疾病。

56、本发明所述的修饰核苷酸能改善sirna药物分子的成药性。在一些实施方案中，本发明所述的修饰核苷酸可增强sirna降解靶基因的效果。因此，本发明所述的修饰核苷酸对于sirna沉默，可增强其药效作用。

57、本发明提供的sirna缀合物由sirna和缀合分子缀合而成，包含有本发明的sirna以及缀合连接至该sirna的缀合基团，所述缀合基团包含接头和药学上可接受的靶向基团和/或递送辅助基团，并且，所述sirna、所述接头和所述靶向基团或者所述递送辅助基团依次共价或非共价连接，每个所述靶向基团选自能够和细胞表面受体结合的配体，每个递送辅助基团选自能够增加所述sirna缀合物在递送目标器官或组织中的生物相容性的基团。

58、在一些实施方案中，包含本发明所述的修饰核苷酸的sirna药物是双链的。就双链sirna药物而言，所述sirna药物的正义和反义链的长度独立地为15-45个核苷酸。在一些实施方案中，双链sirna药物包含彼此至少部分互补(至少70％互补)的正义链和反义链。反义链包含具有与靶mrna中的序列完美互补(100％互补)或至少部分互补(至少85％互补)的序列的区域。正义和反义链可以是相同长度也可以是不同长度。

59、在一些实施方案中，正义链的长度为约19个核苷酸，而反义链的长度为约21个核苷酸。在一些实施方案中，正义链的长度为约21个核苷酸，而反义链的长度为约23个核苷酸。正义链和反义链之间的完美或部分互补区域通常为15-25个核苷酸的长度，且位于反义链的5’-末端或附近(例如该区域距离反义链的5’-末端1、2、3或4个核苷酸，其不完美或部分互补)。

60、就双链sirna药物而言，如果存在其它的正义链核苷酸，则其可以与靶mrna中的相应序列相同或不相同。如果存在其它的反义链核苷酸，则其可以与相应的正义链的其它核苷酸(如果存在的话)互补或不互补。

61、在一些实施方案中，本发明所述的包含所述修饰核苷酸的双链sirna药物的正义链和反义链含有相同数量的核苷酸。在一些实施方案中，本发明所述的sirna药物的正义和反义链含有不同数量的核苷酸。

62、在一些实施方案中，正义链和反义链均含有1至4个硫代磷酸酯连接。

63、在一些实施方案中，本发明的sirna中，每个核苷酸均是修饰或未修饰的核苷酸。在本公开的上下文中，所使用的术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者核苷酸上的碱基是经修饰的碱基的核苷酸。所述修饰的核苷酸不会导致sirna调节基因表达的功能明显削弱或丧失。例如，可以选择j.k.watts，g.f.deleavey，and m.j.damha，chemically modified sirna:tools andapplications.drug discov.today，2008，13(19-20):842-55中公开的修饰的核苷酸。

64、在一些实施方案中，包含所述修饰核苷酸的sirna药物抑制细胞、组织或体内中的靶mrna的表达。在一些实施方案中，将治疗有效量的包含本发明所述的修饰核苷酸的sirna药物给予体内，从而抑制体内中的靶mrna的表达。

65、在一些实施方案中，所述sirna药物用于治疗、预防或控制与靶mrna的表达有关的临床表现。在一些实施方案中，将治疗或预防有效量的一种或多种sirna药物给予需要这种治疗、预防或控制的对象。

66、本发明所述的包含所述修饰核苷酸的sirna药物以及包含本发明所述的sirna药物的组合物，可以使用本领域已知的寡核苷酸递送技术递送至细胞、肿瘤、组织或对象。一般来说，可以将本领域适合于(在体外或体内)递送核酸分子的任意方法，应用于本发明所述的包含一个或多个修饰核苷酸的sirna药物。

67、在一些sirna药物为双链的实施方案中，靶向性配体或靶向性基团、连接基团或递送载体与正义链共价连接形成缀合物。在一些实施方案中，靶向性配体、连接基团和/或递送载体直接地或通过接头间接地与正义链的3’或5’末端连接。

68、在一些实施方案中，靶向性配体或靶向性基团含有二到四个末端n-乙酰基半乳糖胺(galnac)，其与包含一个或多个所述修饰核苷酸的sirna药物连接。已知三触角型(galnac)结合asgpr的亲和性大于二触角型或单触角型结构(connolly等，j.biol.chem.,1982,257,939-945)。

69、关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

70、本发明中术语“衍生基团”，指一种简单化合物中的氢原子或原子团被其他原子或原子团取代，而衍生得到较复杂的产物。

71、本发明中，如无特别说明，大写字母c、g、u、a、t表示核苷酸的碱基组成，包括修饰和未修饰的核苷酸；m表示与该标识m右侧相邻的一个核苷酸为2’-甲氧基核苷酸；f表示与该标识f右侧相邻的一个核苷酸为2’-氟核苷酸；d表示与该标识d右侧相邻的一个核苷酸为2’-脱氧核苷酸；gn表示表示与该标识gn右侧相邻的一个核苷酸为甘油核苷酸(gna)；标识*表示与该标识*左右相邻的两个核苷酸之间(或核苷酸与接头-靶向配体部分之间)为硫代磷酸酯基连接；evp表示与其右侧相邻的一个核苷酸是(e)-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸；iab表示反向脱碱基残基。

72、本发明中“寡核苷酸”指连接的核苷的聚合物，其中每一个核苷可独立地被修饰或不被修饰，包含有约10-50个单链核苷酸或双链核苷酸碱基对的寡聚核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸具有与细胞内表达的靶基因核心序列至少部分互补的核碱基序列。在一些实施方案中，寡核苷酸在递送至表达基因的细胞后，能调控相应靶基因的表达。靶基因表达可以在体外或体内被调控。“寡核苷酸”包括但不限于：单链反义寡核苷酸、短干扰rna(sirna)、双链rna(dsrna)、微小rna(mirna)、短发夹rna(shrna)、核酶、干扰性rna分子和dicer酶底物。

73、本发明中“sirna”是指含有能够以序列特异性方式降低或抑制信使rna(mrna)翻译的rna或rna类(例如化学修饰的rna)寡核苷酸分子。

74、sirna可以通过rna干扰机制(例如通过与哺乳动物细胞的mrna干扰通路机制(rna诱导沉默复合物risc)的相互作用来诱导mrna降解)、或其它任意机制或通路发挥作用。虽然认为本发明所用的术语sirna药物主要通过rna干扰机制发挥作用，但所述sirna药物并不受限于或局限于任何特定的作用通路或机制。sirna药物包括但不限于：单链反义寡核苷酸、短干扰rna(sirna)、双链rna(dsrna)、微小rna(mirna)、短发夹rna(shrna)和dicer酶底物。本发明所述的sirna药物由具有与作为靶标的mrna至少部分互补的寡核苷酸链构成。在一些实施方案中，本发明所述的sirna药物是双链的，且由反义链和与该反义链至少部分互补的正义链构成。

75、术语“沉默”、“减少”、“抑制”、“下调”、或“敲减”指给定的基因表达时，用本发明所述的sirna药物分子处理细胞、组织、器官或动物体内直接给药时，与未经如此处理的细胞、组织、器官或动物体内给药相比，基因的表达水平有所减少或降低。

76、术语“序列”或“核苷酸序列”是指核碱基或核苷酸的顺序或次序，使用标准核苷酸命名法以字母顺序表示。

77、术语“杂环碱基”是本发明所定义的核碱基或修饰核碱基。在一些实施方案中，杂环碱基部分是嘧啶、取代的嘧啶、嘌呤或取代的嘌呤以及含氮杂环。在一些实施方案中，杂环碱基部分是非常规的嘌呤或取代的嘌呤。在一些实施方案中，杂环碱基部分是非常规的嘧啶或取代的嘧啶。在一些实施方案中，杂环碱基部分含有非天然五元含氮杂环。在一些实施方案中，杂环碱基部分可以包含一个或多个保护基团。

78、本发明中“核苷酸碱基”或“核碱基”是杂环嘧啶或嘌呤化合物，其中“常规核苷碱基”包括腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)常规核苷酸的碱基。核碱基可以被修饰或被新型非常规核碱基替代。核苷酸碱基包括天然存在的核苷酸碱基以及非天然存在的核苷酸碱基。这对本领域技术人员来说应该是很明显的，即以前认为是“非天然存在的”各种核苷酸碱基后来在自然界均已发现。因而，“核苷酸碱基”不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且还包括其杂环类似物和互变异构体。核苷酸碱基的示范性例子有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-n6-甲基腺嘌呤、7-二氮杂黄嘌呤、7-二氮杂鸟嘌呤、n4，n4-桥亚乙基胞嘧啶、n6，n6-桥亚乙基-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(c3-c6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷和描述于benner等的美国专利号5432272中的“非天然存在的”核苷酸碱基。术语“核苷酸碱基”包括这些例子中的每一种和全部及其类似物和互变异构体。特别重要的核苷酸碱基有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶，它们被认为是与人类治疗学和诊断学应用有关的天然存在的核苷酸碱基。

79、术语“互补”在用于描述第一核苷酸序列(例如sirna药物正义链或靶标mrna)和第二核苷酸序列(例如单链反义寡核苷酸或双链sirna药物反义链)之间的关系，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多寡核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多寡核苷酸在某些条件下杂交(在哺乳动物生理条件下或类似的体外条件下)形成碱基配对并形成双链体或双螺旋结构的能力。互补序列包含沃森-克里克碱基配对或非沃森-克里克碱基配对，且包含天然或修饰的核苷酸或核苷酸类似物，其程度至少能满足上述杂交的要求。例如，就确定相同性或互补性的目的而言，单体a和af与u(或t)互补，并且等同于a。

80、术语“正义链”是指rna分子上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，又称编码链、有义链或正链，而与其互补的另外一条核苷酸序列即为反义链。

81、术语“反义链”与目标基因表达的mrna中的一段长度与所述反义链相同的核苷酸序列基本上反向互补或实质上反向互补。

82、术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。

83、术语“取代”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够通过现有技术手段和实验条件下(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。

84、碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀ca～cb烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，c1～6烷基是指包含1～6个碳原子的直链或支链的烷基。

85、烷基是指烷烃分子中直链或支链的烃基，例如甲基-ch3、乙基-ch2ch3、亚甲基-ch2-；烷基基团也可以是其他基团的一部分，所述其他基团例如为c1～c6烷氧基，c1～c6烷基氨基。非限制性实施例则包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、正己基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧基、羧基或羧酸酯基。

86、“烯基”是指具有至少2个碳原子且具有至少1个乙烯基不饱和位点(>c＝c<)的直链或支链烃基基团。例如，ca-b烯基是指具有a至b个碳原子的烯基基团并且意在包括例如乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1,3-丁二烯基等。

87、“炔基”是指含有至少一个三键的直链一价烃基或支链一价烃基。术语“炔基”还意在包括具有一个三键和一个双键的那些烃基基团。例如，c2-6炔基意在包括乙炔基、丙炔基等。

88、“烷氧基”指-o-(烷基)或者-o-(环烷基)，其中烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。

89、“卤素”为氟、氯、溴或碘。

90、“卤代取代的烷基”指被一个或多个卤素取代的烷基，其中烷基如上所定义。

91、“酯基”指-c(o)o(烷基)或-c(o)o(环烷基)，其中烷基和环烷基如上所定义。

92、“酰基”指含有-c(o)r基团的化合物，其中r为烷基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基。

93、“杂原子”杂原子是指有机化合物中，除了碳和氢以外的其他原子。一般指在分子骨架(特别是环系)中替换碳的原子。氮、氧、硫、磷、硼、氯、溴、碘等都是常见的杂原子。若有机化合物中有包括杂原子的环，称为杂环化合物。

94、本发明中“保护基”是指本领域已知的用于防止反应性基团(例如羟基、氨基、羧基和巯基)在合成过程中发生不希望反应的不稳定的化学部分。保护基团通常选择性和/或正交地用于在反应中的其它反应性位点保护位点，并且随后被除去而释放出未保护的基团，使其能够用于进一步反应。在一些实施方案中，“取代的”基团或取代基包含保护基团。

95、本发明中代表性的羟基保护基团公开于beaucage等人，tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及greeneand wuts，protective groups in organic synthesis，chapter2,2d ed，john wiley&sons，new york，1991中，以引用的方式将上述文献各自整体并入本文。在一些实施方案中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方案中，本发明可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(dmt)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基氧杂蒽-9-基(pixyl)和9-(对甲氧基苯基)氧杂蒽-9-基(mox)。在一些实施方案中，本发明可使用的羟基保护基的非排他性实例包括tr(三苯甲基)、mmtr(4-甲氧基三苯甲基)、dmtr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)和tmtr(4,4',4”-三甲氧基三苯甲基)。

96、本发明所述的化合物和组合物可以具有处于质子化或脱质子化状态的某些原子(例如n、o或s原子)，这取决于该化合物或组合物所处的环境。因此，如本发明所用，本发明所述的结构考虑到某些官能团、例如oh、sh或nh可以质子化或脱质子化。本发明的公开内容旨在涵盖上述的化合物和组合物，而无论它们的基于环境ph的质子化状态如何，这是本领域普通技术人员容易理解的。

97、术语“盐”和“可用的盐”是指上述化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。

98、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。