检测结核分枝杆菌复合群和利福平耐药的试剂、试剂盒和检测装置的制作方法

本技术涉及基因检测，特别是涉及一种检测结核分枝杆菌复合群和利福平耐药的试剂、试剂盒和检测装置。

背景技术：

1、结核病是由结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌等引起的慢性传染性疾病，结核病的治疗包括多种药物的长期给药，正确地使用抗结核药物通常对结核治疗效果显著。然而，目前耐药结核病（dr-tb）越来越多见，dr-tb的治疗成功率仅约60%。其中，利福平耐药菌已被证实与编码rna聚合酶β亚基（rpob）基因发生突变有关，其中约95%的突变都发生rpob上的507-533密码子（共81bp）利福平耐药决定区，因此，通过对该区域的突变进行检测，能给出耐药信息。

2、目前，临床上对结核分枝杆菌利福平耐药的检测方法主要有基于培养的药敏检测和基于核酸的分子生物学检测。传统的药敏检测方法耗时长、操作复杂，首先需要4到8周的时间在分离培养的基础上进行结核分枝杆菌的鉴定，然后再需要1到2周的时间进行液体药敏检测或者4到8周的时间进行传统固体比例法检测。基于核酸的分子生物学检测主要有pcr-反向点杂交和熔解曲线，其中pcr-反向点杂交需要在正常pcr扩增后进行杂交、洗膜和显色等步骤，因此操作复杂，总检测时间也较长。而熔解曲线方法操作简单，检测灵敏度高，但由于利福平耐药决定区序列的多变性和复杂性，且对于一个区域设计多条探针采用熔解曲线法进行检测，连续的两条探针之间可能会有荧光基团和/或淬灭基团的干扰，导致出现复杂的干扰峰，影响结果判断。为了避免两条探针之间的干扰，现有技术通过分两管反应体系来对rpob基因突变进行利福平耐药性检测，这虽然解决了单管反应探针干扰的问题，但分两管反应增加了操作的复杂性和检测的试剂成本，且降低了检测的通量，不利于广泛应用。

3、因此，如何在单管内实现利福平耐药的简单、多重、高特异性和敏感度的检测仍是本领域的研究重点和难点。

技术实现思路

1、本技术的目的是提供一种检测结核分枝杆菌复合群和利福平耐药的试剂、试剂盒和检测装置。

2、为了解决上述问题，本技术采用了以下技术方案：

3、本技术的第一方面公开了一种检测利福平耐药的试剂，所述试剂包括覆盖rpob基因利福平耐药决定区的多个探针，包括：第一探针，序列如seq id no.1所示；第二探针，序列如seq id no.2所示；第三探针，序列如seq id no.3所示；第四探针，序列如seq id no.4所示；其中：所述多个探针包括双标记探针和单标记探针；所述双标记探针的一端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团；所述单标记探针的一端标记有荧光基团，另一端不标记有荧光基团或淬灭基团；所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针和所述第四探针的探针类型依次为：双标记探针、单标记探针、双标记探针和单标记探针；或，双标记探针、单标记探针、单标记探针和双标记探针；或，单标记探针、双标记探针、单标记探针和双标记探针；且所述第一探针和所述第二探针共用一个淬灭基团，所述第三探针和所述第四探针共用一个淬灭基团。需要说明的是，第一探针、第二探针、第三探针和第四探针覆盖结核分枝杆菌rpob基因上的507-533密码子（序列信息：nc_000962.3）共81bp的利福平耐药决定区，能够针对该区域中的突变进行检测，进而对利福平敏感或耐药进行检测。此外，通过使相邻两个探针共用一个淬灭基团，进行熔解曲线分析时，可以在单管检测的情况下通过形成的正峰和负峰来进行密集单核苷酸变异检测，在单管对利福平敏感的结核分枝杆菌进行诊断，具有简单方便和多重检测的优势。

4、本技术的一种实现方式中，所述覆盖rpob基因利福平耐药决定区的多个探针还包括：第五探针，序列如seq id no.5所示；第六探针，序列如seq id no.6所示；其中，所述第五探针和所述第一探针的基团标记情况相同，所述第六探针和所述第二探针的基团标记情况相同。需要说明的是，第五探针和第六探针能够对rpob利福平耐药决定区的常见缺失突变进行检测，由此，能够进一步提高利福平耐药的检出率。

5、本技术的一种实现方式中，所述第一探针、所述第二探针、所述第三探针和所述第四探针中，双标记探针之间的荧光基团互不相同，单标记探针之间的荧光基团互不相同。由此，能够通过不同的荧光信号区分不同的正峰/负峰，避免正峰之间/负峰之间造成混淆。

6、本技术的一种实现方式中，所述荧光基团选自fam、fitc、hex、vic、tet、joe、rox、cy3、cy5、cy5.5、cy7、atto 425和sf670，所述淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、mgb和dabcyl。

7、本技术的一种实现方式中，所述试剂还包括扩增rpob基因利福平耐药决定区的引物组，包括：第一上游引物，序列如seq id no.7所示；第一下游引物，序列如seq id no.8所示。

8、本技术的第二方面公开了一种检测结核分枝杆菌复合群和利福平耐药的试剂盒，包括如本技术第一方面公开的试剂，还包括：特异性检测is6110的第一引物探针组和/或特异性检测is1081的第二引物探针组。需要说明的是，由此能够同时对是否携带结核分枝杆菌复合群和是否携带利福平耐药菌进行检测。

9、本技术的一种实现方式中，所述第一引物探针组包括：第二上游引物，序列如seqid no.9所示；第二下游引物，序列如seq id no.10所示；第七探针，序列如seq id no.11所示；所述第二引物探针组包括：第三上游引物，序列如seq id no.12所示；第三下游引物，序列如seq id no.13所示；第八探针，序列如seqid no.14所示；其中，所述第七探针和所述第八探针均为双标记探针。

10、本技术的第三方面公开了一种结核分枝杆菌复合群和利福平耐药的检测装置，其特征在于，包括：扩增模块：采用如本技术第二方面的试剂盒对待测样本进行荧光定量pcr检测，并进行熔解曲线分析；判断模块：根据ct值（cycle threshold，循环阈值，是指 pcr反应达到预先设定的阈值荧光信号强度所需要的循环数）判断所述待测样本中是否含结核分枝杆菌复合群，熔解曲线的tm值（melting temperature，熔解温度，是指双链 dna 开始解链为单链 dna 时的温度）判断所述待测样本中是否含利福平耐药菌。

11、本技术的一种实现方式中，在所述pcr扩增模块的pcr反应体系中，所述第一上游引物和所述第一下游引物的摩尔比为1：5。需要说明的是，需要说明的是，在扩增过程中，聚合酶具有5’-3’的外切酶活性，设计上下游引物不对称扩增，主要扩增探针靶向的单链，能够有利于避免探针在延伸过程被聚合酶水解。本技术通过实验研究发现第一上游引物和第一下游引物的摩尔比为1：5时具有更强的检测信号。

12、本技术的一种实现方式中，在所述pcr扩增模块的pcr反应体系中，所述第二上游引物或所述第二下游引物与所述第七探针的摩尔比为5：1。需要说明的是，本技术通过使实验研究发现检测is6110的引物探针浓度比为5：1时，具有较好强的检测信号和较小的干扰信号。

13、本技术的一种实现方式中，在所述pcr扩增模块的pcr反应体系中，所述第三上游引物或所述第三下游引物与所述第八探针的摩尔比为5：1。需要说明的是，本技术通过使实验研究发现检测is1081的引物探针浓度比为5：1时，具有较好强的检测信号和较小的干扰信号。

14、本技术的一种实现方式中，在所述pcr扩增模块，使用了pcr增强剂，所述pcr增强剂包括甜菜碱、二甲亚砜和20000聚乙二醇，在pcr反应体系中，甜菜碱浓度为1m、二甲亚砜浓度为2%、20000聚乙二醇的浓度为5%。需要说明的是，本技术通过使实验研究发现在pcr反应体系中，甜菜碱浓度为1m、二甲亚砜浓度为2%、20000聚乙二醇的浓度为5%时，具有较好的扩增效果。还需要说明的是，本技术中，甜菜碱的浓度单位为摩尔/升，二甲亚砜和20000聚乙二醇浓度的单位为质量分数，质量分数1%代表含量为1g/100ml。

15、本技术的有益效果在于：

16、本技术中，通过使相邻两个探针共用一个淬灭基团，进行熔解曲线分析时，可以在单管检测的情况下通过形成的正峰和负峰来进行密集单核苷酸变异检测，具有简单方便和多重检测的优势；且多个探针覆盖位点检测互不影响，能够在单管里进行多个突变位点的准确检测。