一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测鸭腺病毒3型的试剂组合及其试剂盒以及应用

本发明属于微生物检测领域，具体涉及用于鸭腺病毒3型rpa-crispr/cas12a检测的试剂组合、试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、鸭腺病毒3型(duck adenovirus3，dadv-3)属于腺病毒科禽腺病毒属成员，是一种无囊膜的双链dna病毒。dadv-3具有较强的致病力，感染后发病的鸭临床剖检病变主要表现为肝脏和肾脏的肿大、出血及坏死，发病率为40％～55％，死亡率为35％～43％。目前，该病毒已成为危害养鸭业持续健康发展的重要病原之一。

2、重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,rpa)主要依赖于3种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链结合蛋白和链置换dna聚合酶，模拟生物体内dna复制，可在37℃-42℃范围内进行。因rpa反应条件温和、扩增效率高，设备简单，近几年在病毒、支原体、衣原体、细菌和寄生虫等病原检测方面得到了广泛开发与应用，适用于病原的基层及现场检测。

3、crispr-cas系统源于细菌抵御病毒入侵的免疫防御系统，可通过cas蛋白切割靶标dna。crispr/cas12a作为一种新兴的分子生物学工具，可以用于病原的快速恒温检测。研究人员发现cas12a能在crrna的引导下特异识别并剪切带有pam序列的dsdna靶标，反式切割活性被激活后对标记荧光基团的非靶序列的单链dna进行切割，可根据产生的荧光信号进行结果的判定。

4、目前dadv-3的检测方法主要有病原学鉴定、血清学试验和聚合酶链式反应(pcr)等相关技术。其中，病原学鉴定及血清学试验耗时长且存在灵敏度低、需要贵重仪器和不易操作等问题。因此，需要研究一种快速、便携、灵敏度高、特异性强和操作简单的dadv-3现场检测方法。

技术实现思路

1、本发明目的在于克服现有技术的不足，提出一种用于dadv-3现场检测的crispr/cas12a试剂组合、试剂盒及其检测方法，能够高效、灵敏、特异性地检测dadv-3。

2、本发明的目的通过如下技术方案实现：

3、本发明提供一种用于鸭腺病毒3型dadv-3检测的crrna，crrna的序列如下：uaauuucuacuaaguguagauucuccuugaggauuaguucuaac

4、另一方面，本发明提供用于鸭腺病毒3型dadv-3检测的引物组，引物组的序列如下：

5、

6、经实验验证，本发明最终选定的一种基于rpa-crispr/cas12a检测鸭腺病毒3型的试剂组合，它包括引物对和crrna；

7、所述引物对为dadv-3-fibir2-rpa-f1/dadv-3-fibir2-rpa-r1、dadv-3-fibir2-rpa-f1/dadv-3-fibir2-rpa-r2 、dadv-3-fibir2-rpa-f2/dadv-3-fibir2-rpa-r3 、dadv-3-fibir2-rpa-f2/dadv-3-fibir2-rpa-r4，这4对引物对中的任意一对；

8、其中，引物dadv-3-fibir2-rpa-f1、dadv-3-fibir2-rpa-r1、dadv-3-fibir2-rpa-r2、dadv-3-fibir2-rpa-f2、dadv-3-fibir2-rpa-r3、dadv-3-fibir2-rpa-r4的核苷酸序列分别为：

9、dadv-3-fibir2-rpa-f1：5’-cacttacaatcgaccctggcaaaggactgga-3’；dadv-3-fibir2-rpa-r1：5’-gtcttctgaagtgtgtcagatccactcgtaa-3’；dadv-3-fibir2-rpa-r2：5’-gaagtgtgtcagatccactcgtaaagacata-3’；dadv-3-fibir2-rpa-f2：5’-atcgatcaatcactctccgttagaactaatc-3’；dadv-3-fibir2-rpa-r3:5’-cacttgggcttgtgtcttctgaagtgtgtca-3’；dadv-3-fibir2-rpa-r4:5’-ccctgctccgcagcacacttgggcttgtgtc-3’；

10、所述crrna的核苷酸序列为：

11、5’-uaauuucuacuaaguguagauucuccuugaggauuaguucuaac-3’。

12、优选的，所述的基于rpa-crispr/cas12a检测鸭腺病毒3型的试剂组合，它包括引物对dadv-3-fibir2-rpa-f1/dadv-3-fibir2-rpa-r2和crrna。

13、所述的基于rpa-crispr/cas12a检测鸭腺病毒3型的试剂组合，它还包括ssdna探针，所述ssdna探针的核苷酸序列为5’-ttatt-3’。

14、所述ssdna探针的两端分别连接荧光基团或生物素，所述荧光基团为fam、bhq，生物素为biotin。

15、所述ssdna探针的5’端标记有fam且3’标记有bhq，即所述ssdna探针为5’-fam-ttatt-bhq-3’，该ssdna探针主要用于荧光法中；所述ssdna探针的5’端标记有fam且3’标记有biotin，即所述ssdna探针为5’-fam-ttatt-biotin-3’，该ssdna探针主要用于试纸条法中。

16、一种检测鸭腺病毒3型的rpa-crispr/cas12a检测试剂盒，它包括所述的试剂组合。

17、所述的rpa-crispr/cas12a检测试剂盒，它还包括核酸扩增试剂、crrna转录试剂和cas12a酶。

18、所述的rpa-crispr/cas12a检测试剂盒，所述核酸扩增试剂为rpa扩增试剂。

19、所述的rpa-crispr/cas12a检测试剂盒，它还包括ssdna探针，所述ssdna探针的核苷酸序列为5’-fam-ttatt-bhq-3’。

20、如所述的rpa-crispr/cas12a检测试剂盒在鸭腺病毒3型非诊断目的检测中的应用。

21、所述的应用，包括以下步骤：

22、(1)提取待检测样本的dna，作为模板dna；

23、(2)将步骤(1)所得的模板dna加入rpa反应体系充分混匀，采用引物对进行核酸扩增反应；所述核酸扩增反应为重组酶介导等温核酸扩增反应，包括rpa扩增反应；

24、其中，rpa扩增反应的rpa扩增体系和rpa反应条件如下：

25、rpa扩增体系：向含冻干酶粉的rpa反应管中加入rehydration buffer10μl，引物对中的上下游引物各0.5μl且上下游引物的浓度为20μm、浓度为100ng/ul的dna模板1μl，最后加入2μl starter，加入6μl ddh2o，使总反应体系为20μl；

26、rpa反应条件：将上述rpa反应体系充分混匀，在37-42℃条件下，扩增10-30min；

27、优选的，rpa反应条件为37-40℃条件下，扩增10-20min，更优选的，反应温度39℃，反应时间20min。

28、(3)将crrna、ssdna探针和cas12a酶与步骤(2)中得到的rpa产物混合，进行cas12a荧光检测反应；其中cas12a荧光检测反应体系如下：

29、20μl反应混合物中包含5μl rpa产物、2μl cleavage buffer、1μl 50nm crrna、1μl 100μm lbcas12a和0.6μl浓度为4μm的ssdna探针5`-fam-ttatt-bhq-3’，加入10.4μlddh2o；

30、cas12a荧光检测反应条件为：在35-40℃下孵育10-40min，荧光检测可在蓝光下拍照，可以采用酶标仪检测荧光信号。优选的，在37℃下孵育25min，在蓝光下拍照。

31、当然rpa产物还可进行cas12a试纸条检测反应，此时ssdna探针为，5’-fam-ttatt-biotin-3’，反应混合物的其他组分和用量同荧光检测法；

32、cas12a试纸条检测反应条件为：在35-40℃下孵育10-40min，试纸条检测可根据检测线判读结果。优选的，在37℃下孵育25min。取2μl cas12a试纸条检测反应的产物，加入78μl稀释液，混匀后滴入试纸条上的加样孔，5分钟内读取检测结果。采用“消线法”试纸条进行检测，crrna识别rpa产物后，cas蛋白被激活并切割reporter释放信号。在质控线有条带的前提下，若检测线未出现条带，即“消线”，则判定阳性；反之则为阴性。

33、在本发明中，重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)为常用的恒温扩增技术，在扩增过程中使用重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶，在39℃恒温下进行核酸快速扩增。rpa体系的重组酶来源于t4噬菌体，在本发明的一些实例中，可购买商业化的rpa体系的核酸扩增试剂进行反应。

34、在本发明中，crispr/cas12a作为一种新兴的分子生物学工具，可应用于病原的快速恒温检测。研究人员发现cas12a能在crrna的引导下特异识别并切割含pam序列的dsdna靶标，激活反式切割活性对携带荧光基团的非靶标单链dna进行切割，根据产生的荧光信号进行结果的判定。该方法的主要特点在于高效快速、操作简单、特异性强、灵敏度高，适用于现场检测。利用试纸条检测法，可通过肉眼直接观察试纸条的条带进行结果的判定，该方法适合基层使用，不需要实验室的昂贵仪器就能检测。

35、较之现有技术而言，本发明的优点在于：本发明提供引物对与crrna组合的rpa-crispr/cas12a检测体系，其具有极高的特异性及灵敏度，且能够在现场准确检测dadv-3，且对其它类别常见水禽病毒检测呈阴性；本发明实施例的检测方法使用rpa-crispr/cas12a技术能在45min内完成高效率的基因扩增和结果判读，优选的以引物对dadv-3-fibir2-rpa-f1/dadv-3-fibir2-rpa-r2和crrna建立的rpa-crispr/cas12a检测体系最低检测限可检测初始模板浓度3.0×100copies/μl的dadv-3的dna，时间短、操作方便、灵敏度高、结果判断简单。