含补骨脂素的诱导胚胎成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞的组合物配方及其诱导方法

本发明属于再生医学领域，具体涉及含补骨脂素的诱导胚胎成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞的组合物配方及其诱导方法。

背景技术：

1、心肌细胞，又称心肌纤维，是构成心脏组织的基本细胞，对维持心脏的正常功能起着至关重要的作用。心肌细胞是人体中为数不多的非可再生细胞之一，心肌细胞的非可再生性是指，一旦心肌细胞受到损伤或死亡，它们无法像其他类型的细胞那样通过细胞分裂进行自我修复或再生。这是心肌细胞的一个独特特性，也是心脏疾病治疗中的一个重要挑战。

2、心肌细胞是心脏泵血的动力来源，它们通过有效的收缩和放松推动血液循环。了解心肌细胞的形态、结构和功能特性，是深入理解心脏泵血机制的基础。心肌细胞的这种特殊结构和功能，使它们能够协同工作，确保心脏能够持续、有规律地泵血，为全身各组织器官提供必要的氧气和营养物质。许多心脏疾病，如心肌梗死、冠心病、心肌炎、心力衰竭等，都与心肌细胞的损伤、死亡或功能障碍密切相关。通过研究心肌细胞在疾病状态下的变化，可以揭示这些心脏疾病的发病机制。例如，心肌梗死是由于冠状动脉闭塞导致心肌细胞严重缺血、缺氧而坏死；心力衰竭则是由于多种原因引起心肌细胞收缩力减弱或心室顺应性降低，导致心脏泵血功能下降。

3、心肌细胞作为心血管疾病研究的重要对象，其研究成果不仅有助于揭示心脏疾病的发病机制和治疗靶点，还可以推动整个心血管疾病研究领域的进展。例如，通过构建基于心肌细胞的心血管系统疾病模型，可以模拟疾病的发生和发展过程，为药物筛选和疗效评价提供重要的平台。此外，心肌细胞电生理特性的研究也为心律失常等心脏电生理疾病的诊断和治疗提供了新的视角和方法。

4、综上，诱导心肌细胞生成在促进心脏再生与修复、推动心血管疾病研究进展、促进药物研发与临床应用等方面具有重要意义。但用于诱导心肌细胞生成的细胞来源有限，即使采用合适的细胞来源和诱导方法，心肌细胞的分化效率也往往较低，难以满足临床需求。因此，亟需提供一种高效率诱导心肌细胞生成的方法，用于研究心脏泵血机制、揭示心脏疾病发病机制、指导心脏疾病的诊断和治疗、推动心血管疾病研究进展以及促进个性化医疗的发展。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种含补骨脂素的组合物可以有效提高小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts, mefs）直接重编程为心肌样细胞(inducedcardiomyocytes, icms)的效率。

2、一方面，本发明提供了一种诱导制备icms的组合物，所述组合物包括补骨脂素、2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-1,5-萘啶和毛喉素。

3、具体地，所述的补骨脂素、2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-1,5-萘啶和毛喉素的浓度分别可以是：1µmol/l-100µmol/l、1µmol/l-10µmol/l、1µmol/l-10µmol/l。

4、在一些实施例中，所述的补骨脂素、2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-1,5-萘啶和毛喉素的浓度分别可以是：10µmol/l、5µmol/l、10µmol/l。

5、在另一些实施例中，所述的补骨脂素、2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-1,5-萘啶和毛喉素的浓度分别可以是：1µmol/l、10µmol/l、10µmol/l。

6、在又一些实施例中，所述的补骨脂素、2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-1,5-萘啶和毛喉素的浓度分别可以是：100µmol/l、1µmol/l、1µmol/l。

7、具体地，所述组合物添加在基础培养基中。

8、进一步具体地，所述基础培养基包括但不限于dmem/f12、imdm、m-199、rpmi-1640、mem或dmem中的至少一种。

9、优选地，所述基础培养基可以是高糖 dmem。

10、具体地，所述基础培养基还包括胎牛血清、青-链霉素、l-抗坏血酸-2-磷酸三钠、β-巯基乙醇、its或非必需氨基酸中的至少一种。

11、优选地，所述基础培养基还包括胎牛血清、青-链霉素、l-抗坏血酸-2-磷酸三钠、β-巯基乙醇、its和非必需氨基酸。

12、又一方面，本发明提供了一种诱导制备心肌样细胞的方法，所述方法包括以下步骤：将纤维细胞与组合物相接触，诱导成纤维细胞发生细胞重编程，产生心肌样细胞。

13、具体的，所述组合物包括补骨脂素、2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-1,5-萘啶和毛喉素。

14、进一步具体地，所述的补骨脂素、2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-1,5-萘啶和毛喉素的浓度分别可以是：1µmol/l-100µmol/l、1µmol/l-10µmol/l、1µmol/l-10µmol/l。

15、进一步具体地，所述组合物添加在基础培养基中。

16、优选地，所述基础培养基包括但不限于：dmem/f12、imdm、m-199、rpmi-1640、mem或dmem中的至少一种。

17、进一步优选地，所述基础培养基可以是高糖 dmem。

18、更进一步具体地，所述基础培养基还包括胎牛血清、青-链霉素、l-抗坏血酸-2-磷酸三钠、β-巯基乙醇、its或非必需氨基酸中的至少一种。

19、优选地，所述基础培养基还包括胎牛血清、青-链霉素、l-抗坏血酸-2-磷酸三钠、β-巯基乙醇、its和非必需氨基酸。

20、进一步优选地，所述胎牛血清、青-链霉素、l-抗坏血酸-2-磷酸三钠、β-巯基乙醇、its和非必需氨基酸的浓度为：5%-15%v/v，0.5%-2%v/v，30-70mg/l，0.05-0.2mm，1x-5x，1x-5x。

21、优选地，所述胎牛血清、青-链霉素、l-抗坏血酸-2-磷酸三钠、β-巯基乙醇、its和非必需氨基酸的浓度为：5%-10%v/v，1%-2%v/v，30-50mg/l，0.1-0.2mm，1x-2x，1x-2x。

22、进一步优选地，所述胎牛血清、青-链霉素、l-抗坏血酸-2-磷酸三钠、β-巯基乙醇、its和非必需氨基酸的浓度为：10%v/v，1%v/v，50mg/l，0.1mm，1x，1x。

23、具体的，所述成纤维细胞来源于小鼠胚胎。

24、进一步具体地，所述成纤维细胞来源于10-15天的小鼠胚胎。

25、优选地，所述成纤维细胞来源于12-14天的小鼠胚胎。

26、进一步优选地，所述成纤维细胞来源于13.5天的小鼠胚胎。

27、又一方面，本发明提供了前述的组合物或方法诱导制备的心肌样细胞。

28、又一方面，本发明提供了前述的组合物或方法在制备心肌样细胞中的应用。

29、又一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括前述的组合物以及至少一种基础培养基

30、具体地，所述基础培养基包括但不限于dmem/f12、imdm、m-199、rpmi-1640、mem或dmem中的至少一种。

31、优选地，所述基础培养基可以是高糖 dmem。

32、进一步具体地，所述基础培养基还包括胎牛血清、青-链霉素、l-抗坏血酸-2-磷酸三钠、β-巯基乙醇、its或非必需氨基酸中的至少一种。

33、优选地，所述基础培养基还包括胎牛血清、青-链霉素、l-抗坏血酸-2-磷酸三钠、β-巯基乙醇、its和非必需氨基酸。

34、具体地，2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-1,5-萘啶可被替代为其它tgf-β抑制剂。

35、具体地，补骨脂素可被替代为异补骨脂素。

36、本发明中2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1h-吡唑-4-基]-1,5-萘啶为repsox（r）；毛喉素为forskolin(f)；补骨脂素为psoralen（p）。

37、本发明所取得的技术效果：

38、（1）在repsox+forskolin的基础上加入补骨脂素可以在8h-4d内诱导出自发跳动细胞。

39、（2）在repsox+forskolin的基础上加入补骨脂素可以诱导更多ctnt阳性细胞。

40、（3）在repsox+forskolin的基础上加入补骨脂素可以诱导更多α-actinin阳性细胞。

41、（4）在repsox+forskolin的基础上加入补骨脂素以提高细胞ryr2、tnnt2、myh6、β-mhc mrna表达水平。