一种用于吐鲁番黑羊快速鉴定的SNP位点组合及其应用

本发明涉及生物，具体涉及一种用于吐鲁番黑羊快速鉴定的snp位点组合及其应用。

背景技术：

1、吐鲁番黑羊俗称“托克逊黑羊”，是托克逊县农牧民在长期的生产生活中，经过上百年的时间，在长期的选育下形成了适应夏季酷热、冬季严寒、多风沙的吐鲁番盆地气候；能耐受粗纤维多、木质化强、多刺的、耐盐碱抗干旱的牧草植物，且能快速增膘和生长迅速等特点的优良地方绵羊品种。

2、分子标记技术(molecular marker technology)是分子育种中的重要工具。传统分子标记，例如限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，rflp)和简单序列重复(simple sequence repeat，ssr)在遗传育种领域中发挥着重要作用。

3、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)指基因组单个核苷酸的变异，包括单个碱基对的转换、颠换、插入或缺失。snp作为基因组中分布更为广泛的遗传标记，具有密度高、遗传稳定性高和易于自动化分析等特点，已发展成为动物遗传变异研究中较为常见的分子标记。

4、目前基因组学成为研究家畜性状的方法之一，利用基因组学技术对影响目标性状的基因进行预测，通过分子标记技术寻找影响目标性状的具体突变位点，在绵羊基因组选择、绵羊性状相关基因的定位、绵羊遗传多样性分析、绵羊品种鉴定、绵羊亲缘关系鉴定或绵羊种质资源改良与保护中都具有现实的意义。

5、然而，到目前为止，国内外对于吐鲁番黑羊的snp位点研究较少。因此，有必要研究吐鲁番黑羊的snp位点组合，可为吐鲁番黑羊品种鉴定与保护奠定基础。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供用于吐鲁番黑羊快速鉴定的snp位点组合及其应用，本发明首次经过深入的研究，从大量群体snp位点(29282739个)中筛选得到适用于吐鲁番黑羊快速鉴定的snp特征位点组合。应用这些snp特征位点组合可将吐鲁番黑羊从15个绵羊品种鉴别出来。

2、为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种用于吐鲁番黑羊快速鉴定的snp位点组合，所述snp位点组合包括：

4、第一snp位点，所述第一snp位点为：

5、位于吐鲁番黑羊1号染色体56051334位置的碱基c或t；

6、位于吐鲁番黑羊1号染色体148518362位置的碱基a或g；和

7、位于吐鲁番黑羊1号染色体235100056位置的碱基g或a。

8、第二snp位点，所述第二snp位点为：

9、位于吐鲁番黑羊2号染色体170361249位置的碱基a或g。

10、第三snp位点，所述第三snp位点为：

11、位于吐鲁番黑羊3号染色体94073598位置的碱基c或t；

12、位于吐鲁番黑羊3号染色体94126664位置的碱基a或c；

13、位于吐鲁番黑羊3号染色体96060726位置的碱基a或t；

14、位于吐鲁番黑羊3号染色体96411788位置的碱基c或t；

15、位于吐鲁番黑羊3号染色体96505358位置的碱基t或c；

16、位于吐鲁番黑羊3号染色体98395197位置的碱基g或c；和

17、位于吐鲁番黑羊3号染色体98512230位置的碱基c或t。

18、第四snp位点，所述第四snp位点为：

19、位于吐鲁番黑羊8号染色体82065597位置的碱基g或a。

20、第五snp位点，所述第五snp位点为：

21、位于吐鲁番黑羊10号染色体31970870位置的碱基c或t；

22、位于吐鲁番黑羊10号染色体32392169位置的碱基a或g；

23、位于吐鲁番黑羊10号染色体32413913位置的碱基c或t；

24、位于吐鲁番黑羊10号染色体32578996位置的碱基c或t；

25、位于吐鲁番黑羊10号染色体32607823位置的碱基g或a；

26、位于吐鲁番黑羊10号染色体32705836位置的碱基g或a；和位于吐鲁番黑羊10号染色体32856410位置的碱基c或t；第六snp位点，所述第六snp位点为：

27、位于吐鲁番黑羊12号染色体17926984位置的碱基c或t；

28、位于吐鲁番黑羊12号染色体18054030位置的碱基a或g；

29、位于吐鲁番黑羊12号染色体18094851位置的碱基a或g；

30、位于吐鲁番黑羊12号染色体18231786位置的碱基g或c；

31、位于吐鲁番黑羊12号染色体18391974位置的碱基c或t；

32、位于吐鲁番黑羊12号染色体18434311位置的碱基c或t；

33、位于吐鲁番黑羊12号染色体18450195位置的碱基c或t；

34、位于吐鲁番黑羊12号染色体18614238位置的碱基c或t；

35、位于吐鲁番黑羊12号染色体18629464位置的碱基c或a；

36、位于吐鲁番黑羊12号染色体19093295位置的碱基c或t；

37、位于吐鲁番黑羊12号染色体27549147位置的碱基c或a；

38、位于吐鲁番黑羊12号染色体27652807位置的碱基t或c；

39、位于吐鲁番黑羊12号染色体27834009位置的碱基a或g；

40、位于吐鲁番黑羊12号染色体28649071位置的碱基g或a；

41、位于吐鲁番黑羊12号染色体29019345位置的碱基g或a；

42、位于吐鲁番黑羊12号染色体29337598位置的碱基c或t；

43、位于吐鲁番黑羊12号染色体29649706位置的碱基c或t；

44、位于吐鲁番黑羊12号染色体30033245位置的碱基g或a；

45、位于吐鲁番黑羊12号染色体30078910位置的碱基c或t；

46、位于吐鲁番黑羊12号染色体30088003位置的碱基c或g；

47、位于吐鲁番黑羊12号染色体30344040位置的碱基c或a；

48、位于吐鲁番黑羊12号染色体30724299位置的碱基c或t；

49、位于吐鲁番黑羊12号染色体31130129位置的碱基c或a；和位于吐鲁番黑羊12号染色体31272032位置的碱基c或t；第七snp位点，所述第七snp位点为：

50、位于吐鲁番黑羊13号染色体36560505位置的碱基t或c；

51、位于吐鲁番黑羊13号染色体36993560位置的碱基c或t；

52、位于吐鲁番黑羊13号染色体42528464位置的碱基g或a；

53、位于吐鲁番黑羊13号染色体44210047位置的碱基c或t；

54、位于吐鲁番黑羊13号染色体44414519位置的碱基g或a；

55、位于吐鲁番黑羊13号染色体44655182位置的碱基g或c；

56、位于吐鲁番黑羊13号染色体44788195位置的碱基a或t；

57、位于吐鲁番黑羊13号染色体44805577位置的碱基c或t；和位于吐鲁番黑羊13号染色体47655278位置的碱基c或t。

58、第八snp位点，所述第八snp位点为：

59、位于吐鲁番黑羊17号染色体6801157位置的碱基c或t。第九snp位点，所述第九snp位点为：

60、位于吐鲁番黑羊21号染色体22253455位置的碱基c或t；第十snp位点，所述第十snp位点为：

61、位于吐鲁番黑羊24号染色体18892540位置的碱基c或t；

62、位于吐鲁番黑羊24号染色体18925844位置的碱基t或a；

63、位于吐鲁番黑羊24号染色体18976050位置的碱基a或g；

64、位于吐鲁番黑羊24号染色体19159661位置的碱基a或c；

65、位于吐鲁番黑羊24号染色体19412107位置的碱基g或a；

66、位于吐鲁番黑羊24号染色体19900682位置的碱基c或t；

67、位于吐鲁番黑羊24号染色体19923644位置的碱基t或g；

68、位于吐鲁番黑羊24号染色体20229355位置的碱基t或c；

69、位于吐鲁番黑羊24号染色体20449215位置的碱基t或c；和

70、位于吐鲁番黑羊24号染色体30323863位置的碱基a或g。

71、第十一snp位点，所述第十一snp位点为：

72、位于吐鲁番黑羊25号染色体35036193位置的碱基a或c；和

73、位于吐鲁番黑羊25号染色体35042644位置的碱基c或t。

74、优选的，所述snp位点的位置是基于绵羊参考基因组ars-ul ramb v2.0序列确定的。

75、第二方面，提供一种用于吐鲁番黑羊快速鉴定的snp芯片，所述snp芯片包括本发明所述的snp位点组合。

76、第三方面，提供一种用于吐鲁番黑羊快速鉴定的snp液相芯片，所述snp液相芯片包括本发明所述的snp位点组合。

77、第四方面，提供一种用于检测本发明所述的snp位点组合的引物对，所述引物对包括：

78、第一引物对，用于检测所述第一snp位点；

79、第二引物对，用于检测所述第二snp位点；

80、第三引物对，用于检测所述第三snp位点；

81、第四引物对，用于检测所述第四snp位点；

82、第五引物对，用于检测所述第五snp位点；

83、第六引物对，用于检测所述第六snp位点；

84、第七引物对，用于检测所述第七snp位点；

85、第八引物对，用于检测所述第八snp位点；

86、第九引物对，用于检测所述第九snp位点；

87、第十引物对，用于检测所述第十snp位点；和

88、第十一引物对，用于检测所述第十一snp位点。

89、在本发明中，本发明进一步公开了用于检测所述的snp位点组合的引物对，根据本发明所述吐鲁番黑羊snp位点对应序列即可设计正向引物和反向引物。引物设计原则为本领域技术人员所熟知。

90、第五方面，提供一种用于检测本发明所述的snp位点组合的探针，所述探针包括：

91、第一探针，用于检测所述第一snp位点；

92、第二探针，用于检测所述第二snp位点；

93、第三探针，用于检测所述第三snp位点；

94、第四探针，用于检测所述第四snp位点；

95、第五探针，用于检测所述第五snp位点；

96、第六探针，用于检测所述第六snp位点；

97、第七探针，用于检测所述第七snp位点；

98、第八探针，用于检测所述第八snp位点；

99、第九探针，用于检测所述第九snp位点；

100、第十探针，用于检测所述第十snp位点；和

101、第十一探针，用于检测所述第十一snp位点。

102、在本发明中，所述探针能够与核酸中含有所述snp位点的区域退火或杂交，所述探针的核苷酸序列能够与核酸中snp位点上下游的核苷酸序列互补，且不与所述核酸中snp位点的核苷酸序列互补。并且，所述探针标记有报告基团和淬灭基团，其中，所述报告基团能够发出信号，所述淬灭基团能够吸收或淬灭所述报告基团发出的信号；所述探针在与其互补序列杂交的情况下发出的信号不同于在未与其互补序列杂交的情况下发出的信号。

103、在本发明中，所述探针包含或者由天然存在的核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸(pna)或锁核酸)，或其任何组合组成。

104、在本发明中，所述探针具有3'-oh末端；或者所述探针的3'-末端是封闭的；例如，通过在探针的最后一个核苷酸的3'-oh上添加化学部分(例如生物素或烷基)，通过将探针的最后一个核苷酸的3'-oh去除，或者将所述最后一个核苷酸替换为双脱氧核苷酸，从而封闭探针的3'-末端。

105、在本发明中，所述探针为自淬灭探针；例如，所述探针在其5'末端或上游标记有报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团。所述探针各自独立地具有相同或不同的报告基团。

106、第六方面，提供一种用于检测本发明所述的snp位点组合的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的引物对。

107、在本发明中，引物(primers)是一种短的单链dna或rna片段，它的主要功能是在dna复制、pcr(聚合酶链式反应)、测序、基因工程等过程中，作为起始点或模板来启动或引导dna链的合成。pcr是一种在体外迅速扩增特定dna片段的技术，通过高温变性、低温退火和中温延伸三个步骤的循环，实现dna片段的指数级增长。在这个过程中，一对人工合成的引物被设计来与目标dna的两条链的特定区域互补。这些引物在pcr的退火步骤中与模板dna结合，随后在dna聚合酶的作用下，从引物的3'端开始，沿着模板链合成新的dna链。引物的设计需要考虑多个因素，包括引物的长度(通常为15-30个核苷酸)、gc含量(即鸟嘌呤和胞嘧啶的比例，影响引物的熔解温度)、熔解温度(tm，即引物与模板链结合并解离的温度)、特异性(即引物与目标序列的互补性程度，避免非特异性扩增)、二级结构(避免引物自身形成环状或发夹结构)以及引物之间的相互作用(避免引物二聚体形成)等。

108、在本发明中，根据上述snp位点的位置，在绵羊参考基因组上前后各延伸60bp，将包括目标位点(snp位点)在内一共121bp的碱基的反向互补序列作为该目标位点的探针序列。其余位点的探针序列采用同样的方式确定后，通过石家庄博瑞迪生物技术有限公司进行探针合成，从而得到用于吐鲁番黑羊快速鉴定的snp芯片或用于吐鲁番黑羊快速鉴定的snp液相芯片。

109、第七方面，提供一种用于检测本发明所述的snp位点组合的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的探针。

110、第八方面，提供本发明所述的snp位点组合在吐鲁番黑羊育种中的应用。

111、第九方面，提供本发明所述的snp位点组合在吐鲁番黑羊品种鉴定中的应用。

112、在本发明中，提取吐鲁番黑羊基因组dna的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组dna提取方法或试剂盒进行。根据本发明的一些具体示例，采用血液基因组dna试剂盒提取待测吐鲁番黑羊的基因组dna。由此，能够有效获得质量好、纯度高的基因组dna，便于后续步骤进行。

113、在本发明中，将吐鲁番黑羊基因组dna进行pcr扩增的条件不受特别限制。

114、在本发明中，对所述pcr扩增产物进行测序的方法不受特别限制，只要能够有效获得pcr扩增产物即snp标记所在的片段的序列即可。根据本发明的一些具体示例，可以采用选自hiseq2000、454和sanger测序方法的至少一种对所述pcr扩增产物进行测序。由此，能够高通量、快速、高效、准确地获得测序结果。

115、相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

116、本发明从大规模测序数据中挖掘吐鲁番黑羊关键功能位点及品种特异位点，筛选出可用于芯片设计的66个snp位点，均为新筛选的snp位点，将筛选出的snp位点设计成芯片可以实现基因分型，在吐鲁番黑羊育种中的多个领域均具有较高的应用价值。

117、进一步的，本发明所涉及的snp芯片，特别是snp液相芯片基于靶向捕获测序技术，不仅可以对目标位点进行分型，同时目标位点周围一定范围内的snp也可以被准确分型，因此可以得到比标记位点更多的snp分型信息。与传统固相芯片相比，灵活性较高，可以根据应用需要随时添加标记位点；同时，液相芯片依托二代测序平台，分型成本较低，为大规模分型提供技术手段。

118、本发明提供的用于吐鲁番黑羊快速鉴定的snp位点组合，本发明首次经过深入的研究，从大量群体snp位点(29282739个)中筛选得到适用于吐鲁番黑羊快速鉴定的snp特征位点组合。应用这些snp特征位点组合可将吐鲁番黑羊从15个绵羊品种中鉴别出来。

119、本发明提供的snp位点具有准确性高、变异丰富、操作简单等优点，且开发出的snp位点不受环境因素影响，能直接反应动物基因水平的差异，因而可以被广泛应用于吐鲁番黑羊鉴定以及吐鲁番黑羊资源的保护。经过样本测试验证，发明人证实，上述snp位点组合对于吐鲁番黑羊样本数据量在2.8gb时位点检出率在95％以上，表明本发明提供的snp位点组合有用信息量多，具有较大的利用价值。此外，本发明开发的snp位点组合在吐鲁番黑羊全基因组11条染色体上均匀分布，可以提高相关研究应用的准确性。

120、本发明的snp位点组合能将吐鲁番黑羊从其它14个品种羊中区分，准确率高；本发明的snp位点组合可作为分子标记物用于羊种质资源鉴定、辅助育种等技术；本发明可进一步收集疑似吐鲁番黑羊个体，防止杂种个体混入污染血缘，有利于有效提高种羊育种的经济效益，对吐鲁番黑羊群体规模的扩大及后续合理开发利用有重要意义。