一种工程化微生物及其在微生物细胞或代谢产物生产中的应用的制作方法

本发明涉及微生物，尤其涉及一种工程化微生物及其在微生物细胞或代谢产物生产中的应用。

背景技术：

1、在微生物发酵过程中，微生物细胞的生长和生物量的积累往往是影响代谢产物生产性能的关键因素，而很多微生物在生物量积累至一定程度后，开始进入生长平台期，生长速率大幅降低，这也成为很多代谢产物无法持续高效合成和积累的限制因素。

2、微生物往往通过释放小分子物质在细胞之间进行交流，并且在达到临界数量后会发出通告，这种小分子物质被称为群感效应分子。然而关于群感效应分子如何影响微生物发酵过程中的生物量积累和产物合成的研究报道在盐单胞菌中仍较少。如何突破微生物的生长和生物量积累限制以提升产物的合成效率仍是目前亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明提供一种工程化微生物及其在微生物细胞或代谢产物生产中的应用。

2、盐单胞菌在发酵过程中当菌体密度达到一定程度后，菌体无法进一步向更高密度增殖，生长期较短，限制了发酵密度和生物量的上限。本发明在盐单胞菌的发酵过程中发现，上述发酵密度和生物量的限制主要是由于群感效应分子的存在导致的。在盐单胞菌中，群感效应分子是高丝氨酸内酯（ahl），这种小分子在群感效应中发挥重要作用，也正是由于群感效应分子高丝氨酸内酯的存在，导致盐单胞菌的发酵密度无法突破现有限制，各种代谢产物的产量也因此受到制约，很难从增加生物量的角度提高代谢产物的产量。本发明进一步发现，将高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低能够解除上述菌体生长限制，延长菌体生长期，显著提高菌体的生物量以及代谢产物（如pha）产量。

3、具体地，本发明提供以下所述的技术方案。

4、第一方面，本发明提供高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低在提高微生物的生物量和/或代谢产物的生产性能中的应用；所述高丝氨酸内酯合成酶的氨基酸序列为seq id no.1所示序列编码的氨基酸序列。

5、第二方面，本发明提供高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低在选育具有提高的生物量和/或代谢产物的生产性能的微生物中的应用；所述高丝氨酸内酯合成酶的氨基酸序列为seq id no.1所示序列编码的氨基酸序列。

6、本发明中，所述生物量是指发酵制得微生物细胞的重量（优选为干重，也可用发酵液的吸光度表征生物量）。

7、所述代谢产物为其合成速率与微生物生长速率偶联或部分偶联的代谢产物。

8、优选地，所述代谢产物包括选自聚酯、蛋白质、氨基酸、核酸、核苷酸或其衍生物、有机酸或其衍生物中的一种或多种。

9、进一步优选地，所述代谢产物为pha。

10、所述代谢产物的生产性能包括代谢产物的产量、转化率和/或生产强度。其中，所述转化率为目标产物相对于发酵底物的转化率；所述生产强度为单位时间内的目标产物产量。

11、本发明中，所述微生物为细菌或真菌。优选为嗜盐菌，更优选为盐单胞菌。

12、作为示例，所述盐单胞菌为盐单胞菌（ halomonas bluephagenesis）或盐单胞菌（ halomonas campaniensis）。

13、本发明中，对于实现 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低的技术手段没有特殊限制，例如，可采用常用的基因工程手段和基因编辑方法对所述基因、其编码蛋白、其调控元件或调控蛋白进行修饰，以使得 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低。

14、示例性地，所述基因的表达量和/或其编码蛋白的活性降低通过以下（1）~（3）中的任意一种或多种方式的组合实现：

15、（1）对蛋白的氨基酸序列进行突变；

16、（2）对基因的核苷酸序列进行突变；

17、（3）将基因的转录和/或翻译调控元件替换为活性更弱的元件。

18、以上所述的氨基酸序列的突变包括缺失、插入或替换一个或多个氨基酸。

19、以上所述的核苷酸序列的突变包括缺失、插入或替换一个或多个核苷酸。

20、以上所述的转录、翻译调控元件包括启动子、核糖体结合位点等。

21、优选地，所述高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低通过失活高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts实现。

22、优选地，所述失活通过敲除实现。

23、本发明中，微生物的选育可采用基因工程改造、诱变、适应性进化等方法。

24、第三方面，本发明提供一种产pha的工程化微生物，所述微生物中高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低。

25、优选地，所述微生物为细菌或真菌。优选为嗜盐菌，更优选为盐单胞菌。

26、作为示例，所述盐单胞菌为盐单胞菌（ halomonas bluephagenesis）或盐单胞菌（ halomonas campaniensis）。

27、优选地，所述微生物中，高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts失活。

28、所述基因失活可通过对所述基因进行一个或多个核苷酸的插入、缺失或替换的方式实现。优选地，所述基因失活通过基因敲除实现。

29、优选地，所述高丝氨酸内酯合成酶的氨基酸序列为seq id no.1所示序列编码的氨基酸序列。

30、优选地，所述工程化微生物的生物量和/或pha生产性能因高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低而提高。

31、对于所述产pha的工程化微生物的出发菌株，本发明没有特殊限制，可为任意具有pha合成能力且含有高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的细菌（优选为嗜盐菌，更优选为盐单胞菌）。本发明通过在多株盐单胞菌中进行验证，确定了高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低的改造策略在盐单胞菌中具有普适性，不依赖于出发菌株的特定遗传背景；通过降低高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性，不同盐单胞菌在氮源等营养物质供应充足的发酵条件下，生物量均显著提升，pha的产量也均显著提升。

32、第四方面，本发明提供以上所述的工程化微生物的构建方法，所述方法包括：修饰所述微生物以使得其中高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低。

33、第五方面，本发明提供以上所述的工程化微生物在微生物细胞生产或代谢产物生产中的应用。

34、优选地，所述代谢产物为其合成速率与微生物生长速率偶联或部分偶联的代谢产物。

35、优选地，所述代谢产物包括选自聚酯、蛋白质、氨基酸、核酸、核苷酸或其衍生物、有机酸或其衍生物中的一种或多种；更优选为pha。

36、优选地，所述应用包括：对以上所述的工程化微生物进行发酵培养。

37、在所述发酵培养过程中，在菌体生长阶段给予充足的碳源、氮源和氧气。

38、作为本发明的优选方案，提供以上所述的工程化微生物在pha生产中的应用。

39、第六方面，本发明提供一种pha的生产方法，所述方法包括：对以上所述的工程化微生物进行发酵培养，收集培养物中的pha。

40、优选地，在所述发酵培养过程中，在菌体生长阶段给予充足的碳源和氮源。

41、本领域技术人员知晓，pha发酵培养过程可分为菌体生长阶段（发酵前期）和pha合成阶段（发酵后期）。菌体生长阶段和pha合成阶段可根据菌体生长曲线和生长速率判断。当细胞净生物量的比生长速率μ<0.01时（通常为发酵16h左右，本发明的失活 hdts基因的工程化微生物的菌体生长阶段延长至24h左右）可视为菌体生长阶段结束，进入pha合成阶段。

42、上述在菌体生长阶段给予充足的碳源、氮源是指在发酵培养基中添加碳源和氮源，并在培养基中的碳源和氮源消耗完或消耗至较低浓度时开始向发酵体系中流加碳源和氮源。

43、对于流加碳源和氮源的浓度和速率，本领域技术人员可通过检测发酵体系中碳源和氮源的消耗情况，根据消耗速率确定补料速率。确定合适的补料速率以保证发酵体系中存在充足的碳源和氮源供菌体生长是本领域常规技术手段。

44、优选地，在发酵8-24小时以流加补料的方式向发酵体系中补充氮源；在发酵过程中，以流加补料的方式向发酵体系中补充碳源，以维持发酵体系中碳源的含量不低于5g/l。

45、优选地，在发酵8-24小时向发酵体系中流加包含质量比为（0.03-0.07）：1的氮源和碳源的补料液，补料液的流加速率以维持发酵体系中碳源的含量为5-15g/l为准；在发酵24小时以后，向发酵体系中流加碳源以维持发酵体系中碳源的含量为5-15g/l。

46、优选地，所述碳源为选自葡萄糖、淀粉中的一种或多种，所述氮源为选自尿素、铵盐中的一种或多种。

47、示例性地，所述碳源为葡萄糖，所述氮源为尿素，在发酵培养基中添加葡萄糖和尿素，并在菌体生长阶段（发酵8-24h）持续流加尿素和葡萄糖的混合液（其中尿素和葡萄糖的质量比为（0.04-0.06）：1），流加速率以控制发酵体系中葡萄糖浓度为8-12g/l为准；在发酵24小时以后，向发酵体系中流加葡萄糖以维持发酵体系中葡萄糖浓度为8-12g/l。

48、优选地，所述发酵培养以糖类物质为碳源。

49、优选地，所述发酵培养使用的培养基中还包含5-100g/l氯化钠（优选为20-40g/l）；添加氯化钠的作用主要在于提供嗜盐菌生长所需的渗透压环境。

50、优选地，所述发酵培养的温度为35-37℃。所述发酵培养的ph为8.5-9.0。

51、优选地，在所述发酵培养过程中，通过通气和搅拌控制溶氧为大于0且小于等于70%。更优选为20%-50%。

52、利用嗜盐菌发酵生产pha的主要优势在于，其可以进行开放式发酵而无需额外灭菌，同时，发酵过程中不需要使用各类空气滤膜和复杂的无菌操作来减少染菌的可能性，大大节约了生产成本以及人力物力。嗜盐菌的常规开放式发酵依托于高盐高ph的环境，以抑制其他的杂菌生长。

53、优选地，所述发酵培养使用的培养基包括如下组分：葡萄糖10-30g/l，氯化钠5-30g/l，尿素0.4-0.7g/l，mgso40.1-0.3g/l，kh2po41.3-1.7g/l，以及0.03-0.07g/l fe(iii)-nh4-citrate，0.01-0.04g/l cacl2·2h2o，0.08-0.2mg/l znso4·7h2o，0.02-0.04mg/l mncl2·4h2o，0.2-0.4 mg/l h3bo3，0.1-0.3mg/l cocl2·6h2o，0.008-0.015 mg/l cuso4·5h2o，0.01-0.03 mg/l nicl2·6h2o，0.02-0.04 mg/l namoo4·2h2o。

54、本发明的有益效果至少包括：本发明发现降低高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性能够解除菌体的生长限制，延长菌体生长期，微生物发酵可以达到更高密度的发酵水平，生物量显著提高，而且pha等与生长偶联的代谢产物的产量也显著提高。本发明提供的工程化微生物的生物量和pha产量均明显提升，为pha生产菌的选育提供了有效的改造策略和方法。