抗HPV-18型E蛋白的特异性抗体及其用途的制作方法

本发明属于生物，涉及抗hpv-18型e蛋白的特异性抗体及其用途。

背景技术：

1、人乳头瘤病毒(hpv)是隶属于乳多空病毒科乳头瘤病毒属的一组球形、微小、无包膜的环状双链dna病毒。具有嗜上皮性，主要引起人类皮肤、黏膜的增生性病变，分为高危型、中危型和低危型三大类。症状表现为寻常疣、生殖器疣(尖锐湿疣)等。随着性病中尖锐湿疣的发病率急速上升和宫颈癌、肛门癌等的增多，人乳头瘤病毒(hpv)感染越来越引起人们的关注。

2、单克隆抗体(monoclonal antibody,mab)是由单一b细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体在生物医学研究、疾病诊断和某些疾病治疗(如传染病和癌症)中是十分重要的工具。当前常见的单克隆抗体制备技术主要有杂交瘤、噬菌体抗体库和单个b细胞技术。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了以下的技术方案：

2、本发明提供了一种抗hpv-18型e蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括seq idno：1所示的重链可变区cdr1、seq id no：2所示的重链可变区cdr2、seq id no：3所示的重链可变区cdr3、seq id no：9所示的轻链可变区cdr1、lts所示的轻链可变区cdr2、seq idno：10所示的轻链可变区cdr3。

3、可选的，所述单克隆抗体还包含具有与seq id no：4、5、6、7所示氨基酸序列至少90％序列一致性的重链可变区框架区fr1、fr2、fr3、fr4，以及具有与seq id no：11、12、13、14所示氨基酸序列至少90％序列一致性的轻链可变区框架区fr1、fr2、fr3、fr4。

4、可选的，所述单克隆抗体重链可变区具有与seq id no：8所示的氨基酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的重链可变区，所述轻链可变区具有与seq id no：15所示的氨基酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的轻链可变区。

5、可选的，所述单克隆抗体进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。

6、可选的，所述单克隆抗体来源于人或非人哺乳动物。

7、可选的，所述单克隆抗体是人源化的。

8、本发明提供了核酸分子，所述核酸分子编码前面所述的单克隆抗体或其功能片段。

9、可选的，所述核酸分子包括编码seq id no:1-15任一项氨基酸序列的核苷酸序列。

10、可选的，所述核酸分子编码的核苷酸序列经过密码子简并性处理。

11、本发明提供了一种生产前面所述的单克隆抗体的方法，该方法包括如下步骤：

12、a)提供前面所述的核酸分子；

13、b)用步骤a)所述的物质转化宿主细胞；

14、c)在适合条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；

15、d)在宿主细胞培养液中分离纯化获得前面所述的单克隆抗体。

16、本发明提供了前面所述的单克隆抗体的如下任一用途：

17、1)在制备检测乳头瘤病毒的产品中的用途；

18、2)在制备检查e蛋白的产品中的用途；

19、3)在制备诊断乳头瘤病毒的产品中的用途；

20、4)在制备调节e蛋白的药物中的用途；

21、5)在制备预防或治疗乳头瘤病毒的药物中的用途；

22、可选的，所述乳头瘤病毒包括上皮型hpv与黏膜型hpv；

23、可选的，所述上皮型hpv包括hpv-1、hpv-5、hpv-8、hpv-14、hpv-20、hpv-21、hpv-25、hpv-47型；

24、可选的，所述黏膜型hpv包括hpv-6、hpv-11、hpv-16、hpv-18、hpv-31、hpv-33、hpv-35、hpv-39、hpv-41、hpv-45、hpv-51、hpv-52、hpv-56、hpv-58、hpv-59、hpv-68、hpv-70、hpv-72型；

25、可选的，所述乳头瘤病毒为hpv-18；

26、可选的，所述e蛋白包括hpv病毒e蛋白；

27、可选的，所述hpv病毒e蛋白包括hpv病毒e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7、e8蛋白。

28、可选的，所述药物包括各种本领域药学上可接受的载体。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，具体可以是包括但不限于：缓冲剂，如乙酸盐、tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烃基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；蛋白质，如血清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；张力调节剂，诸如海藻糖和氯化钠；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；表面活性剂，如聚山梨醇酯；成盐抗衡离子，如钠；金属复合物(如zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如或聚乙二醇(peg)。用于体内施用的药物制剂一般是无菌的，实现药物制剂无菌的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过无菌滤膜过滤等方法来实现。本领域技术人员还可以根据药物组合物所需的剂型选择合适的药学上可接受的载体，以将其制备成不同的剂型，例如，本发明的药物组合物可以是包括但不限于片剂、注射剂、冻干剂等各种剂型。

29、本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包含前面所述的核酸分子；

30、可选的，所述重组载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、质粒、dna载体、mrna载体、基于转座子的载体或人工染色体；

31、可选的，所述重组载体为质粒。

32、本发明提供了一种细胞，所述细胞包括前面所述的单克隆抗体，前面所述的核酸分子或前面所述的重组载体。

33、可选的，所述细胞包括原核细胞或真核细胞。

34、可选的，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体。

35、可选的，所述细菌包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌。

36、可选的，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、除蓝藻外植物细胞、真菌细胞、酵母细胞。

37、更可选的，所述哺乳动物细胞包括成纤维细胞、淋巴细胞、上皮细胞、成髓细胞。

38、本发明提供了一种缀合物，所述缀合物包括前面所述的单克隆抗体和与抗体相缀合的物质。

39、可选的，所述物质缀合到抗体之后不影响抗体本身的功能。

40、可选的，所述物质包括荧光染料、化学发光化合物、放射性同位素、酶、或生物素。

41、可选的，所述酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶。

42、示例性的荧光染料包括但不限于呫吨(xanthene)染料、荧光素染料、罗丹明染料、异硫氰酸荧光素(fitc)、6-羧基荧光素(fam)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(hex)、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(joe或j)、n,n,n',n'-四甲基-6-羧基罗丹明(tamra或t)、6-羧基-x-罗丹明(rox或r)、5-羧基罗丹明6g(r6g5或g5)、6-羧基罗丹明6g(r6g6或g6)和罗丹明110；花菁染料，例如cy3、cy5和cy7染料；alexa染料，例如alexa-fluor-555；香豆素、二乙氨基香豆素、伞形酮；苯甲亚胺染料，例如hoechst 33258；菲啶染料，例如德克萨斯红(texas red)；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料、bodipy染料、喹啉染料、芘(pyrene)、荧光素氯三嗪基(fluoresceinchlorotriazinyl)、r110、eosin、joe、r6g、四甲基罗丹明、lissamine、rox和萘并荧光素。

43、可选的，制备所述缀合物的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以将所述单克隆抗体与功能性分子直接或通过合适长度的间隔物进行连接，连接方式可以是化学交联或基因工程融合表达，从而获得所述缀合物。

44、为了治疗目的，与治疗效应物基团例如放射性基团可能是合适的，这些放射性基团即由放射性同位素或放射性核素(例如3h、14c、15n、33p、35s、90y、99tc、111ln、123l、125l、131l、201ti、213bi)、毒素或细胞毒性基团例如细胞生长抑制剂组成或包括其的基团。

45、本发明的单克隆抗体可以与标记基团(标记的多肽)偶联，然后可以使用其例如用于诊断目的。合适的标记基团可以选自放射性同位素(例如上文提到的那些)或含有放射性同位素、放射性核素的基团、荧光基团(例如荧光蛋白例如gfp、rfp等、染料、罗丹明、荧光素及其衍生物例如fitc、花青染料)、酶基团(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶)、化学发光基团、生物素基团、金属颗粒(例如金颗粒)、磁性颗粒(例如具有含有磁铁矿(fe3o4)和/或磁赤铁矿(fe2o3)的核心)、预定的多肽基团等。

46、所述免疫缀合物还可以是嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)，所述嵌合抗原受体可表达于免疫细胞。所述的“免疫细胞”与“免疫效应细胞”可互换使用，其包括：t淋巴细胞，nk细胞或nkt细胞等，优选的，为nk细胞和t淋巴细胞。所述的嵌合抗原受体一般包含顺序连接的：胞外结合区、跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含本发明的抗体或融合蛋白。基于car技术的跨膜区和胞内信号区的设计是本领域公知的：例如跨膜区采用cd8，cd28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(itam)cd3ζ链或fcεriγ酪氨酸激活继续及共刺激信号分子cd28、cd27、cd137、cd134、myd88、cd40等的胞内信号区。

47、如本文所用的术语“荧光标记”、“荧光染料”和“荧光团”是指在限定的激发波长下吸收光能并在不同波长下发射光能的部分。荧光标记的实例包括但不限于：alexafluor染料(alexafluor 350、alexafluor 488、alexafluor 532、alexa fluor 546、alexa fluor568、alexa fluor 594、alexa fluor 633、alexa fluor 660和alexafluor 680)、amca、amca-s、bodipy染料(bodipyfl、bodipy r6g、bodipytmr、bodipytr、bodipy 530/550、bodipy 558/568、bodipy 564/570、bodipy 576/589、bodipy 581/591、bodipy 630/650、bodipy 650/665)、羧基罗丹明6g、羧基-x-罗丹明(rox)、级联蓝、级联黄、香豆素dm-nerf、曙红、赤藓红、荧光素、fam、羟基香豆素、ir染料(ird40、ird 700、ird 800)、joe、丽丝胺罗丹明b、marina蓝、甲氧基香豆素、萘并荧光素、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、pympo、芘、罗丹明b、罗丹明6g、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明绿、2',4',5',7'-四溴砜-荧光素、四甲基罗丹明(tmr)、羧基四甲基罗丹明(tamra)、德克萨斯红、德克萨斯红-x。

48、本文说明性描述的本发明可以在缺少本文未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制条件的情况下适当实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等都应被广泛地理解而不受限制。另外，本文使用的术语和表达已被用作描述的术语而非限制，并且无意使用这些术语和表达来排除所示和所描述的特征的任何等同物或其部分，但是应认识到在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解，尽管已经通过优选实施例和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文所公开的体现在本发明中的修改和变化，并且认为这些修改和变化在本发明的范围内。

49、如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中用作一般术语，包括全长抗体、单链抗体以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“vhh序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。

50、如本文所用，术语“单克隆抗体”指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体显示对特定表位的单结合特异性和亲和性。

51、如本文所用，术语“人源化抗体”指具有基本来自非人物种免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子其余的免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。所述抗原结合位点可包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包含移植到可变结构域中适当构架区的互补性决定区(cdr)。抗原结合位点可以是野生型的，或者通过一个或多个氨基酸替换进行修饰，例如进行修饰以与人免疫球蛋白更为相近。某些形式的人源化抗体保留了全部cdr序列。其他形式具有一个或多个相对于原始抗体而言发生了改变的cdr。

52、如本文所用，两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”指示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用ncbi数据库的blast程序来确定相同性。