一种鉴别中国甜柿基因型的方法及其应用

本发明涉及基因型鉴定，尤其是涉及一种鉴别中国甜柿基因型的方法及其应用。

背景技术：

1、柿(diospyros kaki thunb.，2n＝6x＝90；少数品种2n＝9x＝135)原产我国，是柿属植物中作为果树栽培的代表种，其传统产区在中国、韩国和日本等东亚地区。根据成熟期果实能否自然脱涩及其性状遗传特点，柿品种分为甜涩性状表现质量性状遗传的完全甜柿(pollination-constant and non-astringent,pcna)和数量性状遗传的非完全甜柿(non-pcna)。柿果实在其特化的果肉细胞—“单宁细胞”的液胞内积累大量的柿单宁(persimmontannin或kaki tannin)，也称“原花色素”(proanthocyanidins，简称“pas”)，其平均分子量为14,000da，是普通植物单宁的3-5倍。根据其在醇溶液中溶解性的不同可分为可溶性和不溶性单宁两类，可溶性单宁与口腔唾液蛋白结合后产生强烈的收敛和干燥的感觉(俗称“涩感”)，完全甜柿成熟时可在树上自然脱涩，不需脱涩处理即可脆食；非完全甜柿则在成熟后仍需经人工脱涩处理后才可鲜食。人工脱涩不仅增加生产成本，且脱涩后的果实易软化、运输不便，脱涩不完全更影响商品性。

2、我国拥有世界上最为丰富的柿种质资源，除大别山区有少数中国甜柿资源外，其余均为涩柿。中国甜柿(chinese pcna,c-pcna)为完全甜柿类型，在果实硬食期即可自然脱涩，其自然脱涩机理以单宁的凝固效应为主，有别于日本甜柿的稀释效应。中国原产完全甜柿内部遗传多样性丰富，且控制自然脱涩性状相关基因为显性，而日本原产完全甜柿(简称“日本甜柿”)受隐性基因控制，即中国甜柿的杂交后代中能够产生完全甜柿，日本甜柿必须与日本甜柿之间杂交才能获得完全甜柿，但面临近亲衰退。因此，中国甜柿较日本甜柿具有更重要的育种价值。

3、目前，鉴别中国甜柿的基因型，能为杂交亲本的选择提供参考，而且将基因型用于幼株的胚拯救、绿木嫁接和标记辅助选择的杂交组合，将大大提高pcna育种的效率，对育成具知识产权的完全甜柿新品种具有重要意义。

4、目前，在实际应用中，中国甜柿自然脱涩基因的数量鉴别，依赖于sybr green i荧光染料能与双链dna非特异性结合，结合后发出荧光，可以通过检测反应体系中sybr greeni的荧光强度，达到检测qpcr产物扩增量的目的，但在实际应用中，引物存在非特异性结合，qpcr反应中有非特异性扩增产物的出现会增加荧光值，影响定量结果的准确性，即不同标准曲线得出的结果存在一定差距，对于部分材料没办法得出完全准确的结果，且必须利用三条参考基因的标准曲线才能确定其基因型，材料耗费较大，原程序需要经过完整的pcr反应结合双链后检测荧光信号，时间耗费较长。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种鉴别中国甜柿基因型的方法及其应用，以解决目前中国甜柿基因型鉴别方法具有偏好性，对于部分柿材料的检测结果稳定性差、可靠性低，且耗时长、工作量大的问题，提供一种新的、高效的鉴别方法，助力培育包含中国甜柿遗传背景的完全甜柿新品种。

2、为实现上述目的，本发明提供一种鉴定中国甜柿基因型的方法，包括以下步骤：

3、s1、提取中国甜柿标准样品的基因组dna，根据中国甜柿自然脱涩位点cpcna区间、参考基因序列设计特异性引物和taqman特异探针，将特异性引物和taqman特异探针序列信息送公司合成；

4、s2、将获得的中国甜柿标准样品的基因组dna倍比稀释成不同的浓度，然后分别与中国甜柿自然脱涩位点cpcna区间、参考基因特异性引物和taqman特异探针混合进行实时荧光定量pcr反应，得到不同dna浓度下的ct值；

5、s3、利用得到的中国甜柿标准样品不同dna浓度、不同特异性引物和taqman特异探针下的ct值，建立标准曲线；

6、s4、提取待测柿材料的基因组dna，并稀释成确定浓度，分别与中国甜柿自然脱涩位点cpcna区间、参考基因特异性引物和taqman特异探针混合后进行实时荧光定量pcr反应，获得不同特异性引物和taqman特异探针下的ct值，将获得的ct值分别代入s3建立的标准曲线中，即可计算得到待测柿材料的基因型。

7、优选的，所述s1中中国甜柿标准样品为‘小果甜柿’，参考基因为dkact、l5r；中国甜柿自然脱涩位点cpcna区间特异性引物的上游引物序列如seq id no.1所示，下游引物序列如seq id no.2所示，taqman特异探针的序列如seq id no.3所示。

8、优选的，所述s1中dkact基因的特异性引物的上游引物序列如seq id no.4所示，下游引物序列如seq id no.5所示，taqman特异探针序列如seq id no.6所示；l5r基因的特异性引物的上游序列如seq id no.7所示，下游引物序列如seq id no.8所示，taqman特异探针序列如seq id no.9所示。

9、优选的，所述s2中基因组dna倍比稀释成不同的浓度指：最大浓度为120ng·μl-1，依次进行两倍稀释，共设置八个dna浓度梯度；s3中建立的标准曲线包括中国甜柿自然脱涩位点cpcna区间和参考基因的标准曲线。

10、优选的，所述s4中计算待测柿材料基因型，采用以下公式进行：

11、cpcna相对等位基因剂量＝cpcna连锁标记的相对dna用量/参考基因的相对dna用量×6；

12、式中，cpcna连锁标记的相对dna用量为：将待测柿材料利用中国甜柿自然脱涩位点cpcna特异性引物、taqman特异探针，进行实时荧光定量pcr得到的ct值，代入中国甜柿自然脱涩位点cpcna区间标准曲线计算得到的数值；

13、参考基因的相对dna用量为：将待测柿材料利用参考基因特异引物与taqman特异探针，进行实时荧光定量pcr得到的ct值，代入参考基因标准曲线计算得到的数值。

14、优选的，当cpcna相对等位基因剂量小于0.5时，待测柿材料的基因型为bbbbbb；当cpcna相对等位基因剂量大于等于0.5小于1.5时，待测柿材料的基因型为bbbbbb；当cpcna相对等位基因剂量大于等于1.5小于2.5时，待测柿材料的基因型为bbbbbb，以此类推，当cpcna相对等位基因剂量大于等于5.5小于6.5时，待测柿材料的基因型为bbbbbb。

15、优选的，所述s4中待测柿材料基因组dna的浓度为60ng·μl-1，中国甜柿自然脱涩位点cpcna区间、参考基因特异性引物和taqman特异探针的浓度与s2中的浓度相同。

16、优选的，所述s2和s4中进行实时荧光定量pcr的体系为：5μl probe qpcr mixmultiplus、0.1μl的rox reference dyeⅱfor rr393、10μm/l的上游引物和下游引物各0.2μl、0.1μm/lprobe 0.25μl、基因组dna模板1μl，ddh2o补至10μl。

17、优选的，所述s2和s4中先将基因组dna于95℃变性10min，再与中国甜柿自然脱涩位点cpcna区间、参考基因特异性引物和taqman特异探针混合，进行实时荧光定量pcr的程序为：25℃2min，95℃预变性20s为第一步，一个循环；95℃1s，60℃20s，为第二步，40个循环，第二步中每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测；所述基因组dna包括中国甜柿标准样品的基因组dna和待测柿材料的基因组dna。

18、一种如上所述的鉴别中国甜柿基因型的方法在中国甜柿基因型鉴别、完全甜柿新品种选育中的应用。

19、因此，本发明提供的一种鉴别中国甜柿基因型的方法及其应用，其具体技术效果如下：

20、(1)本发明提供的鉴别中国甜柿基因型的方法，通过探针与目标分子之间发生特异性的水解反应方可生成荧光信号，误差更小，鉴别结果更准确，结果稳定性更高；

21、(2)本发明提供的鉴别中国甜柿基因型的方法，只需要两个参考基因组，鉴定易操作，可以大幅降低中国甜柿基因型鉴别的工作量，试剂耗材等的消耗更少，鉴别成本更低；

22、(3)本发明提供的鉴别中国甜柿基因型的方法，可以大幅缩短鉴别所需时间，提高鉴别效率，对中国甜柿基因型的鉴定可以为杂交亲本的选择提供参考，还可用于幼株的胚拯救、绿木嫁接和杂交组合的标记辅助选择，大幅提高pcna育种效率，对育成具知识产权的完全甜柿新品种、甜柿品种改良具有重要意义。

23、下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。