一种基于单分子磁镊测定不同C2′修饰G-四链体动力学行为的方法

本发明属于生物，具体涉及一种基于单分子磁镊测定不同c2′修饰g-四链体动力学行为的方法。

背景技术：

1、g-四链体结构是一种非传统的核酸结构，通过hoogsteen氢键，富含g碱基的序列可形成四链体螺旋结构。g-四链体是一种存在于人类端粒和癌基因启动子区域的核酸结构，由于其在端粒维护和基因调控中的作用，已经引起了广泛关注，另外，g-四链体还可以作为超分子组装体、基于dna的纳米装置、潜在的抗病毒剂的新型构建块，以及抗癌药物的新一类分子靶点。g-四链体表现出显著的结构多样性，目前针对人类端粒dna的高分辨率结构研究主要集中在能够形成单个四链体的短dna序列上。在许多情况下，这些寡核苷酸序列可以采用并在不同构象之间相互转换，导致结构分析变得复杂。

2、已有研究表明端粒g-四链体和其他rna四链体倾向于形成平行结构，这与鸟苷核糖核苷酸强烈偏好采用反式anti糖苷键构象有关。dg与rg之间的syn/anti构象偏好已被用于调节g-四链体的折叠，并且基于这一策略提出了不同的c2′核苷修饰。不同的c2′核苷修饰g-四链体表现出不同的理化性质，从而来实现dna/rna不具备的生物学功能。这些糖基的修饰改变了g-四链体的构象和动力学行为，在提高生物稳定性、结合亲和力和组织特异性以及减少免疫反应方面提供了理想的物理化学和生物学特性。但目前为止，各种不同c2′修饰对g-四链体中的力学稳定性以及折叠/解折叠速率还未被研究。

3、单分子操纵技术可以定向对生物大分子施加力从而直接操纵生物大分子，该类技术在探究力学感应的生物过程中具有独特优势。单分子磁镊技术是单分子操纵技术中的一种，其一般通过磁场控制超顺磁性小珠的移动，并利用这个小珠捕捉单分子，从而进行性能研究。如公开号为cn117191713a的中国专利文献公开了一种基于单分子磁镊测定非天然核酸链杂交热动力学性质的方法，该发明通过构建xna/dna杂合链单分子发卡，使用所述单分子xna发卡构建了磁镊体系，然后利用单分子磁镊技术进行数据采集，最后使用隐氏马尔科夫模型进行拟合，通过对dna底物精准施力变化，量化不同非天然核酸解离所需要能量以及折叠/解折叠速率。但是修饰过的g-四链体结构与上述发明不同，且修饰过的g-四链体的形成速率相较于完全配对的发卡结构要慢很多，难以通过上述发明的长时间恒力实验来得到它们的折叠/解折叠速率。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足之处，本发明提供了一种基于单分子磁镊测定不同c2′修饰g-四链体动力学行为的方法，该方法通过直接拟合采集到的力爬坡数据测得不同c2′修饰g-四链体折叠/解折叠速率，避免了长时间恒力实验对g-四链体结构稳定性产生的影响。

2、具体采用的技术方案如下：

3、一种基于单分子磁镊测定不同c2′修饰g-四链体动力学行为的方法，包括以下步骤：

4、(1)构建手柄链1和手柄链2，手柄链1和手柄链2分别被不同的官能团修饰，手柄链1和手柄链2具有粘性末端；将c2′修饰g-四链体单链和第一引物、第二引物退火后，与手柄链1和手柄链2通过连接酶连接，制备得到待测样品；

5、(2)构建单分子磁镊体系，利用单分子磁镊技术改变施加在待测样品上的拉力进行力爬坡实验并采集实时数据，通过数学模型根据采集的力爬坡数据分析c2′修饰g-四链体动力学行为；所述的数学模型为单指数模型或bell模型。

6、本发明首先构建带有手柄链的c2′修饰g-四链体，然后利用单分子磁镊技术使手柄链分别连接到磁性珠和基板上，当外部磁场拉动磁性珠时，c2′修饰g-四链体会相应拉伸或扭转。通过记录磁珠的位移变化，结合已知的力-位移关系和特定的数学模型，得出c2′修饰g-四链体的力学性质，如拉伸强度、解折叠行为或结构转换的力学特性。

7、具体的，所述的c2′修饰g-四链体中的核苷进行了2’f-ana修饰、2’f-rna修饰或2’ome-rna修饰。

8、可选的，手柄链1和手柄链2分别被生物素-biotin、巯基-sh修饰。

9、手柄链1和手柄链2通过酶切得到，酶切时的保护碱基为ctgcagaa，手柄链1和手柄链2的序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示。

10、可选的，c2′修饰g-四链体单链和第一引物、第二引物按照等摩尔量混合退火，退火温度从95℃降至25℃，退火时间1.5h。

11、可选的，退火产物、手柄链1和手柄链2按照等摩尔量通过t4连接酶连接，100μl反应体系中加入1.5μl的t4连接酶。

12、单分子磁镊技术可以在pn级别精确控制施加在分子上的力，能够精准的测量g-四链体解离所需的力，具有高精度力控的特点，且磁镊通过磁场控制磁珠的运动，不直接接触样本，避免了物理接触可能引起的干扰或损伤，由于磁力不会对分子样本产生明显的光损伤或其他负面影响，因此适合进行长时间的动态过程观察，能够很容易的观测到分子折叠、解折叠等动力学过程。另外，单分子磁镊能够对单个分子进行分析，避免了群体实验中由于样本异质性导致的数据混杂，提供更高的分辨率，其还可以施加和检测从极低到较高范围的力，适合研究多种力学条件下的分子行为。通过对待测样品精准施力变化，可以量化不同c2′修饰g-四链体解折叠所需要的力的分布以及折叠/解折叠速率。

13、可选的，步骤(2)中，在单分子流动池中，通过待测样品、链霉亲和素磁珠以及被修饰的单分子流动池内底壁之间的反应，使待测样品中手柄链部分分别连接到链霉亲和素磁珠和单分子流动池内底壁上，通过单分子磁镊技术，改变施加在待测样品上的拉力进行力爬坡实验。

14、力爬坡实验过程中，以1pn/s的速率将拉力从1pn逐渐增加至60pn，动力学行为包括折叠速率、解折叠速率，可以通过动力学行为判断c2′修饰g-四链体的结构。

15、单指数模型拟合公式如下：

16、pf(t)＝pst(1-exp(-kft))

17、其中，pf(t)为统计得到的g-四链体折叠概率，pst为稳态折叠概率，kf是g-四链体的折叠速率，t为折叠时间。

18、bell模型拟合公式如下：

19、

20、其中，是g-四链体解折叠的力分布，r是加载速率，kb是玻尔兹曼常数，t是绝对温度，f为变量力，δxu是展开的过渡距离，为解折叠速率。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

22、(1)本发明方法通过bell模型直接拟合采集到的力爬坡数据，克服了长时间恒力实验对g-四链体结构稳定性产生的显著影响，避免了其在力作用下可能出现的解折叠、结构转换或动力学行为改变，从而更加方便快捷的测得不同c2′修饰g-四链体折叠/解折叠速率。

23、(2)c2′修饰可以显著影响g-四链体的稳定性和折叠行为，通过本发明方法，有助于理解g-四链体的结构与其功能之间的关系，设计更稳定或可控的g-四链体，用于生物医学应用，如抗癌药物开发或基因调控，本发明方法还可以揭示修饰对折叠路径的影响，揭示分子折叠的机制，以及为设计基于四链体的药物提供关键数据。