一种突变的ALS多肽及其应用的制作方法

本发明属于农业基因工程领域，具体涉及抗除草剂基因、多肽及其在植物育种中的应用。

背景技术：

1、乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，als)是支链氨基酸合成过程中的一个关键酶，多种除草剂通过抑制植物体内的als酶活性阻止支链氨基酸的合成，进而阻碍细胞分裂期的dna合成，最终使植物停止生长并逐渐枯萎死亡。

2、目前，以als靶标开发了多种除草剂，包括磺酰脲类(sulfonylureas)、咪唑啉酮类(imidazolinones)、三唑嘧啶类(triazolopyrimidines)、嘧啶水杨酸类(pyrimidinyl(thio)benzoates)、三唑啉酮类(sulfonylamino-carbonyl)等化合物，这些化合物统称为als抑制剂类除草剂，这些除草剂具有选择性强、杀菌谱广、低毒高效等特点，目前已大面积推广使用。这类除草剂在杀草的同时，也会对一般不具有抗除草剂特性的农作物本身产生要害，限制了其使用空间；而且随着除草剂使用时间的延长，越来越多的杂草对除草剂产生抗性，使得除草剂的效力降低，缩短了其市场寿命，限制了其使用时间。因此，培育抗除草剂的作物品种是解决上述问题的方法之一，可以扩大除草剂的使用范围，延长其使用寿命。

3、目前，已报道了一些als抗性位点，但突变体的抗性能力和适用的除草剂种类范围有限。因此，若培育具有除草剂抗性高、适用范围广的农作物，本领域还迫切需要开发和改进对als抑制性除草剂的耐受性系统。

4、crispr/cas基因编辑技术是近几年新兴的基因工程技术，其是由guiderna介导的dna切割技术，针对cas的不同已经开发出多种编辑系统，包括cas9、cpf1、cms1、c2c1、c2c2等。crispr/cas编辑技术可以实现三种定点编辑：第一种是基因的定点敲除，cas蛋白在靶向rna(grna)的指导下识别和切割靶点，产生双链dna断裂；断裂的dna通常以非同源末端连接(nhej)来修复；在修复时容易产生移码突变以破坏这个基因。定点敲除的效率都较高。第二种是对靶标进行同源置换来更换靶标序列或者定点插入。在产生双链dna断裂时，如果在附近存在同源修复模板，这时可能发生同源置换或定点插入。同源置换的效率较低，并随着要置换的序列的长度增长而变得更低。第三种是单碱基编辑。单碱基编辑是利用crispr/cas系统将脱氨酶靶向基因组中特定的位点从而对特定碱基进行修饰的基因编辑方法。结合crispr技术，我们可以加快抗性als多肽的筛选，改进作物对als抑制剂的耐受性。对于扩大除草剂使用范围、延长使用寿命具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一种可提高植物对als抑制性除草剂产生抗性或耐受性的突变型als多肽；本发明还涉及突变型als的生物学活性片段，编码所述蛋白或片段的多核苷酸及其应用。

2、一方面，本发明提供了一种乙酰乳酸合成酶(als)的突变多肽，所述突变多肽包括突变的als1和突变的als3；所述突变的als1与亲本als1的氨基酸序列相比，在对应于seqid no.1所示氨基酸序列的第178位氨基酸存在突变；所述突变的als3与亲本als3的氨基酸序列相比，在对应于seq id no.2所示氨基酸序列的第172位氨基酸存在突变。

3、在另一优选例中，所述的突变多肽为除草剂抗性/耐受性多肽，尤其是针对als抑制剂类除草剂的抗性/耐受性。

4、在另一优选例中，所述第178位氨基酸突变为非脯氨酸p，例如，s，a，v，g，q，f，w，y，d，n，e，k，m，t，c，r，h，l，i；优选，s。

5、在另一优选例中，所述第172位氨基酸突变为非脯氨酸p，例如，s，a，v，g，q，f，w，y，d，n，e，k，m，t，c，r，h，l，i；优选，s。

6、在另一优选例中，所述亲本als1多肽的氨基酸序列与seq id no.1所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性。

7、在另一优选例中，所述亲本als3多肽的氨基酸序列与seq id no.2所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性。

8、在另一优选例中，所述亲本als1的氨基酸序列如seq id no.1所示。

9、在另一优选例中，所述亲本als3的氨基酸序列如seq id no.2所示。

10、在另一优选例中，所述突变多肽(除草剂抗性多肽)为seq id no.1所示的多肽经突变形成的。

11、在另一优选例中，所述突变多肽(除草剂抗性多肽)为seq id no.2所示的多肽经突变形成的。

12、在另一优选例中，所述的突变多肽除所述上述突变外，其余的氨基酸序列与seqid no.1所示的序列相同或基本相同。

13、在另一优选例中，所述的突变多肽除所述上述突变外，其余的氨基酸序列与seqid no.2所示的序列相同或基本相同。

14、在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个、更佳地1-5个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白具有除草剂耐受活性(als抑制剂类除草剂)。

15、本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代,这些保守性取代最好根据表1进行替换而产生。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以发生改变(缺失、取代或置换)而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在als的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变。

16、本领域熟知，可以从蛋白质的n和/或c末端改变(置换、删除、截短或插入)一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，从als蛋白的n和/或c末端改变了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的蛋白，也在本发明的范围内。这些改变可以包括通过现代分子方法例如pcr而引入的改变，所述方法包括借助于在pcr扩增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的pcr扩增。

17、应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对dna的突变来制备als蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。

18、本领域技术人员能够理解，本发明als蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变)或者产生(例如使用r-dna技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。

19、本领域技术人员可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或蛋白进化或生物信息系的分析，来鉴定als蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合推定的关键位点氨基酸的突变来确定。

20、表1

21、

22、

23、在另一优选例中，所述亲本als1和亲本als3多肽来源于单子叶植物和/或双子叶植物。

24、在另一优选例中，所述亲本als1和亲本als3多肽来源于选自下组的一种或多种植物：禾本科、豆科、藜科、十字花科植物。

25、在另一优选例中，所述亲本als1和亲本als3多肽来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。

26、在另一优选例中，所述亲本als1和亲本als3多肽来源于大豆。

27、本发明另一方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述突变多肽。

28、在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：基因组序列、cdna序列、rna序列、或其组合。

29、在另一优选例中，所述多核苷酸优选是单链的或双链的。

30、在另一优选例中，所述多核苷酸还含有与之可操作连接的调控元件。

31、在另一优选例中，所述多核苷酸在所述突变多肽的orf的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6×his)、核定位信号或其组合。

32、在另一优选例中，所述多核苷酸还包含与所述突变多肽的orf序列操作性连接的启动子。

33、在另一优选例中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。

34、本发明另一方面，提供一种核酸构建体，所述核酸构建体含有所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。

35、在另一优选例中，所述的调控元件选自下组中的一种或多种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多腺苷酸序列、标记基因。

36、另一方面，本发明还提供了一种载体，所述载体包含有编码本发明的突变型als多肽的核酸序列，优选的，所述载体还包括与上述核酸序列可操作连接的表达调控元件。

37、在另一优选例中，所述的载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体或整合载体。

38、在另一优选例中，载体可以是对宿主细胞内源性的als基因进行基因编辑的载体。

39、在另一优选例中，所述表达载体中还至少含有一个复制起点，以实现自我复制。

40、在另一优选例中，所述载体可以是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。

41、载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。

42、优选地，本发明中的载体是质粒。

43、另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞包括所述的核酸构建体或基因组中整合有所述的多核苷酸。

44、在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或动物细胞或植物细胞。

45、在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。

46、在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。

47、在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

48、在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。

49、在另一优选例中，所述植物包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。

50、另一方面，本发明提供了一种编辑载体系统，所述编辑载体系统包含一种或多种载体，所述一种或多种载体至少包含靶向亲本als的引导序列。所述引导序列含有部分亲本型als的核苷酸序列，优选的至少含有15bp的als核苷酸序列，更优选的至少包括20bp的als核苷酸序列。在一种实施方式中，该编辑载体系统还包括基因编辑酶。所述基因编辑酶包括crispr(规律成簇间隔短回文重复序列clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)、talen(转录激活因子样效应物核酸酶技术tanscriptionactivator-like(tal)effector nucleases)、zfn(锌指核酸技术，zinc finger nuclease)编辑工具的核酸酶。

51、优选地，所述基因编辑酶为cas蛋白，又名crispr酶或cas效应蛋白，其种类包括但并不限于：cas9蛋白、cas12蛋白、cas13蛋白、cas14蛋白、csm1蛋白、fdk1蛋白。

52、优选的，cas蛋白可操作的连接第一调节元件。

53、在其他的实施方式中，所述基因编辑酶为cas12蛋白，例如，cas12a、cas12b、cas12i，所述载体中还包括与该所述cas12蛋白特异性结合的单向重复序列(directrepeat)。单向重复序列与引导序列可操作连接后，构成引导指导序列(grna)。所述grna的引导序列如seq id no.5或seq id no.6所示；优选的，grna可操作的连接第二调节元件。

54、上述调节元件包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、内部核糖体进入位点(ires)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚u序列)。

55、优选的，所述编辑载体系统还包括碱基编辑元件，所述碱基编辑元件选自腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶。

56、优选地，所述碱基编辑元件选自anc689脱氨酶、evofenry脱氨酶、apobec脱氨酶或tada脱氨酶。

57、在一种实施方式中，编辑载体中还包含抗性基因以便于筛选，所述抗性基因包括hyg、bar、kana、rif、spec、amp，所述抗性基因是本领域技术人员所熟知的。

58、优选的，cas蛋白选用dcas12i或其他核酸酶活性失活的cas12i蛋白。其中dcas12i表示d619a突变的cas12i。优选的，所述野生型cas12i蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示。

59、另一方面，本发明提供了一种基因编辑试剂，所述基因编辑试剂能够在植物中产生上述突变多肽；所述基因编辑试剂包括crispr/cas蛋白和grna，所述grna可以靶向植物内源性的als；任选的，所述基因编辑试剂还包括碱基编辑元件，所述碱基编辑元件选自腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶。优选地，所述碱基编辑元件为胞嘧啶脱氨酶。

60、优选地，所述碱基编辑元件选自anc689脱氨酶、evofenry脱氨酶、apobec脱氨酶或tada脱氨酶。优选地，所述碱基编辑元件为anc689脱氨酶。

61、在另一个实施方式中，所述基因编辑试剂包括上述编辑载体系统。

62、本发明另一方面，提供一种试剂，所述试剂可用于提高植物细胞、植物组织或植物的除草剂抗性或耐受性，所述的试剂含有本发明所述的突变多肽或编码突变多肽的核苷酸。

63、本发明另一方面，提供了上述突变多肽，或上述多核苷酸，或上述核酸构建体、或上述宿主细胞在制备具有als抑制性除草剂抗性/耐受性的植物中的应用或者在制备als抑制性除草剂抗性/耐受性植物的试剂或试剂盒中的用途。

64、在另一优选例中，所述als抑制性除草剂选自下组：磺酰脲类(sulfonylureas)、咪唑啉酮类(imidazolinones)、三唑嘧啶类(triazolopyrimidines)、嘧啶水杨酸类(pyrimidinyl(thio)benzoates)、三唑啉酮类(sulfonylamino-carbonyl)或其组合。

65、在另一优选例中，所述的als抑制性除草剂为三唑啉酮类除草剂。

66、在另一优选例中，所述的三唑啉酮类除草剂选自下组：氟唑磺隆(flucarbazone-sodium)、丙苯磺隆(propoxycarbazone-sodium)、噻酮磺隆(thiencarbazone-methyl)或其组合。

67、在另一优选例中，所述的als抑制性除草剂为氟唑磺隆。

68、在另一优选例中，所述的突变多肽与亲本als多肽相比，其对最大als抑制性除草剂的耐受浓度，提高至少1.5倍，优选提高至少2倍，优选提高至少3倍，优选提高至少4倍，优选提高至少5倍，优选提高至少6倍，优选提高至少10倍。

69、在另一优选例中，含有突变多肽的植物相比亲本型植物对als抑制性除草剂的最大耐受浓度至少提高了2倍，优选提高了3倍，优选提高了4倍，优选提高了5倍，优选提高了6倍，优选提高了7倍，优选提高了8倍，优选提高了10倍，优选提高了15倍，优选提高了20倍，优选提高了30倍。

70、在另一优选例中，所述突变型als多肽赋予植物至少0.01mg l-1，优选至少0.05mgl-1，优选至少0.1mg l-1，优选至0.5mg l-1，优选至少1mg l-1，优选至少10mg l-1，优选至少5mg l-1，优选至少10mg l-1-1000mg l-1,优选至少100-1000mg l-1浓度的als抑制性除草剂的耐受性。

71、在另一优选例中，所述植物为单子叶植物和/或多子叶植物。

72、在另一优选例中，所述植物选自下组的一种或多种：禾本科、豆科、藜科、十字花科植物。

73、在另一优选例中，所述植物选自下组的一种或多种：拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。

74、在另一优选例中，所述植物为大豆。

75、本发明另一方面，提供了一种植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物，其包含上述突变多肽，或上述多核苷酸，或上述核酸构建体、或上述宿主细胞。

76、本发明另一方面，提供一种制备所述突变多肽的方法，所述的方法包括步骤：(a)在适合表达的条件下，培养包含所述突变多肽的宿主细胞，从而表达所述的突变多肽；和，任选的，(b)分离所述的突变多肽。

77、本发明另一方面，提供了一种赋予植物对als抑制性除草剂产生抗性/耐受性的方法或者制备具有als抑制性除草剂抗性/耐受性的植物的方法，所述方法包括利用上述基因编辑试剂对植物进行基因编辑的步骤。

78、本发明另一方面，提供一种赋予植物对als抑制性除草剂产生抗性或耐受性的方法或者制备具有als抑制性除草剂抗性/耐受性的植物的方法，所述方法包括在植物细胞、植物组织、植物部分或植物中引入所述als突变多肽的步骤。

79、在另一优选例中，所述方法包括将所述突变多肽在植物细胞、植物组织、植物部分或植物中进行表达的步骤，例如，通过表达载体对所述突变多肽进行表达的，或者将所述编码突变多肽的多核苷酸整合到植物基因组上进行表达。

80、在另一优选例中，所述方法包括自然变异、物理诱变(如紫外线诱变、x射线或y射线诱变)、化学诱变(如亚硝酸、羟胺、ems、亚硝基胍等)、生物诱变(如病毒或细菌介导的诱变)、基因编辑。

81、在另一优选例中，上述方法包括以下步骤：

82、(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的突变多肽或其活性片段的dna编码序列；

83、(2)将植物细胞、植物组织、植物部分与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述突变多肽或其活性片段的dna编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；和

84、(3)选择已转入所述突变多肽或其活性片段的dna编码序列的植物细胞。

85、在另一优选例中，所述方法包括将植物的内源性als进行突变从而引入所述突变多肽的步骤。

86、在另一优选例中，所述方法包括将植物的内源性als核苷酸序列进行突变并表达从而引入所述突变多肽的步骤。

87、在另一优选例中，所述方法包括自然变异、物理诱变(如紫外线诱变、x射线或y射线诱变)、化学诱变(如亚硝酸、羟胺、ems、亚硝基胍等)、生物诱变(如病毒或细菌介导的诱变)、基因编辑。

88、在另一优选例中，所述方法包括将以下步骤：

89、(1)在植物细胞、植物组织、植物部分中引入含有基因编辑工具的表达载体；

90、(2)使基因编辑工具作用于其内源性als编码序列，并使其在相应于seq id no.1和/或seq id no.2的上述突变位点发生突变；

91、(3)筛选突变的植物细胞、植物组织、植物部分；

92、(4)分离所述的基因编辑工具。

93、在另一优选例中，所述的基因编辑工具包括crispr、talen和zfn。

94、另一方面，本发明提供了一种具有除草剂抗性/耐受性的植株，所述植株含有所述突变型als、所述编码突变型als的多核苷酸、所述融合蛋白、载体和核酸构建物中的一种或多种；或者所述的植株基因组中整合有所述的多核苷酸。

95、本发明另一方面，提供一种耐受als抑制性除草剂或对als抑制性除草剂具有抗性/耐受性的植物细胞、植物组织、植物部分、植物，其中，所述植物细胞、植物组织、植物部分、植物含有所述的突变多肽或其多核苷酸序列。

96、本发明另一方面，提供了一种改良植物的方法，所述的方法包括步骤：

97、(a)提供一植物细胞，利用基因工程改造所述植物细胞，从而使所述植物细胞表达所述的als抑制性除草剂抗性多肽；

98、和(b)将步骤(a)中的植物细胞再生成植株。

99、在另一优选例中，所述改良植物包括提高植物对als抑制性除草剂的抗性/耐受性。

100、本发明另一方面，提供一种鉴定或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分的方法，包括：(i)提供转化的植物细胞、植物组织，植物或其部分，其中所述转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分包含所示的多核苷酸或其变体或衍生物，其中多核苷酸编码作为选择标记使用的突变多肽，并且其中所述转化的植物细胞、植物组织、植物或其部份可以包含另一种分离的多核苷酸部份包含；(ii)使转化的植物细胞、植物组织、植物或其部份与至少一种als抑制性除草剂接触；(iii)确定植物细胞、植物组织、植物或其部分是否受抑制性除草剂影响；和(iv)鉴定或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分。

101、本发明另一方面提供一种在植物栽培地点控制不想要的植物的方法，所述方法包括：

102、(1)提供包含所述突变多肽、或所述的多核苷酸、或所述的核酸构建体、或所述宿主细胞的植物，或者提供所述得到的植物；

103、(2)将步骤(1)的植物进行栽培，在所述的栽培地点施用有效量的als抑制性除草剂。

104、在一个实施方式中，所述不想要的植物为杂草。

105、另一方面，本发明还提供了一种控制植物附近杂草生长的方法，其包括：

106、a)提供上述对除草剂具有抗性的植物；

107、b)向所述植物和其附近的杂草施用有效量的除草剂，从而控制所述植物附近的杂草。

108、一般定义

109、除非本技术定义，本发明中所使用的科学术语或专业名词具有本领域技术人员所理解的含义，当本领域技术人员理解的含义与本技术所定义的含义出现矛盾时，以本技术所定义的含义为准。

110、如本文所用，术语“axxb”表示第xx位的氨基酸a变为氨基酸b，例如“p178s”表示第178位的氨基酸p突变为s，以此类推。对于双重或多重突变，各突变之间以“/”或“+”隔开，例如，als1(p178s)/als3(p172s)表示相对于als1氨基酸序列第178位的p被s取代，同时als3氨基酸序列第172位的p被s取代。

111、如本文所用，术语“als”是指乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase)，是支链氨基酸合成过程中的一个关键酶。

112、如本文所用，术语“als抑制剂”、“als除草剂”、“als抑制性除草剂”、“als抑制类除草剂”可互换使用，是指本身有除草活性的物质或者与能改变其效果的其他除草剂和/或添加剂合用的物质，其通过抑制als而起作用。本身能够通过抑制als而起除草作用的物质在本领域中是熟知的，包括磺酰脲类(sulfonylureas)、咪唑啉酮类(imidazolinones)、三唑嘧啶类(triazolopyrimidines)、嘧啶水杨酸类(pyrimidinyl(thio)benzoates)、三唑啉酮类(sulfonylamino-carbonyl)。

113、磺酰脲类(sulfonylureas)除草剂包括：酰嘧磺隆(amidosulfuron)、苄嘧磺隆(bensulfuron-methyl)、氯嘧磺隆(chlorimuron-ethyl)、氯磺隆(chlorsulfuron)、醚磺隆(cinosulfuron)、氟吡磺隆(flucetosulfuron)、啶嘧磺隆(flazasulfuron)、甲嘧磺隆(sulfometuron-methyl)、噻吩磺隆(thifensulfuron methyl)、苯磺隆(tribenuron-methyl)、氟磺隆(prosulfuron)、磺酰磺隆(sulfosulfuron)、氟嘧磺隆(primisulfuron-methyl)、甲酰胺磺隆(foramsulfuron)；咪唑啉酮类(imidazolinones))除草剂包括：咪草酯(imazamethabenz-methyl)、灭草烟(imazapyr)、甲氧咪草烟(imazamox)、咪唑喹啉酸(imazaquin)、甲咪唑烟酸(imazapic)、咪唑乙烟酸(imazethapyr)；三唑嘧啶类(triazolopyrimidines)除草剂包括：氟酮磺草胺(triafamone)、氯酯磺草胺(cloransulam-methy)、双氯磺草胺(diclosulam)、双氟磺草胺(florasulam)、唑嘧磺草胺(flumetsulam)、磺草唑胺(metosulam)、五氟磺草胺(penoxsulam)、啶磺草胺(pyroxsulam)；嘧啶水杨酸类(pyrimidinyl(thio)benzoates)除草剂包括：双草醚(bispyribac-sodium)、嘧啶肟草醚(pyribenzoxim)、环酯草醚(pyriftalid)、嘧草醚(pyriminobac-methyl)、嘧草硫醚(pyrithiobac-sodium)；三唑啉酮类(sulfonylamino-carbonyl)除草剂包括：氟唑磺隆(flucarbazone-sodium)、丙苯磺隆(propoxycarbazone-sodium)、噻酮磺隆(thiencarbazone-methyl)等。优选地，所述除草剂是三唑啉酮类；更优选地，所述除草剂是氟唑磺隆；所述的除草剂可以综合考虑所适用作物或杂草的类型，在于出苗前、出苗后、种植前和种植时控制不想要植物(如杂草)。

114、术语“有效量”或“有效浓度”分别意指这样的量或浓度，所述量或浓度足够杀死相似的亲本(或野生型)植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞或抑制其生长，但是所述量不杀死本发明的抗除草剂植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞或不严重抑制其生长。一般地，除草剂的有效量是农业生产系统中例行用来杀死目的杂草的量。这种量是本领域普通技术人员已知的。本发明所述的除草剂是在任何生长阶段或在种植或出苗之前直接施加至植物或施加至植物的地点时，它们显示除草活性。观察到的效果取决于待控制的植物物种、植物的生长阶段、稀释物的施加参数和喷雾液滴大小、固态组分的粒度、使用时的环境条件、所用的具体化合物、使用的具体辅助剂和载体、土壤类型等，以及施加的化学品的量。如本领域已知，可以调节这些因素和其他因素以促进非选择性或选择性除草作用。

115、术语“亲本核苷酸或多肽”指的是可以在自然界中被发现存在的核酸分子或多肽(蛋白质)，其包括未经人工改造的野生型核酸分子或蛋白质(多肽)，也可以包括经过人工改造但不含有本
技术实现要素：
的核酸分子或蛋白质(多肽)。其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(pcr)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述“亲本植物”即含有亲本核苷酸或多肽的植物。所述“亲本核苷酸或多肽”可以根据本领域技术人员所熟知的技术从亲本植物中进行提取，亦可通过化学合成的方法获得。所述亲本als多肽的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。

116、本发明所述的“耐受性”或“抗性”是指als蛋白或含有蛋白的细胞、组织或植物体，在保持酶活性或生存力或植物生长情况下，所能承受除草剂的能力，一般可以用除草剂的使用量或使用浓度等参数进行表征。进一步的，本发明中“对als抑制性除草剂的耐受性增强”或“对als抑制性除草剂的抗性增强”的als酶是指这样的als酶，与亲本als酶在同等条件下，其最大耐受浓度，表现出比亲本als酶高至少2-30倍。“对als抑制性除草剂的耐受性增强”或“对als抑制性除草剂的抗性增强”的植物是指这样的植物，其对所述als抑制性除草剂的耐受性或抗性与含有亲本als基因的植物相比提高，其耐受浓度相比亲本植物的耐受浓度高至少2倍-30倍。本发明所述的提高“耐受性”或“抗性”的最佳程度为在同等除草剂使用量或浓度下，可以减少或抑制或杀死不想要植物但不影响含有本发明所述突变蛋白的植物的生长或生存能力。

117、本发明所述“赋予植物对als抑制性除草剂产生抗性或耐受性”是包括针对亲本植物中没有对als抑制性除草剂的抗性或耐受性，或亲本植物对als抑制性除草剂有一定或较低的耐受性(在同等除草剂的浓度下)，通过向植物中引入本发明所述的突变多肽或编码突变多肽的核苷酸，从而给予没有抗性的植物一定程度的除草剂抗性或耐受性，提高具有一定或较低耐受性的植物对除草剂的耐受性。

118、术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。术语“突变蛋白”或“突变型蛋白”指的是这样的蛋白质，其与亲本蛋白质的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的取代、插入、缺失和/或添加。如本文所用，术语“除草剂抗性多肽”、“突变的als多肽”、“突变型als多肽”、“突变als蛋白”、“突变als酶”、“突变蛋白”、“突变多肽”、“本发明多肽”等可互换使用。

119、术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cdna或mrna，作为在具有限定的核苷酸序列(即rrna，trna和mrna)或限定的氨基酸序列及其产生的生物学特性的生物学过程中合成其它聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mrna的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。

120、术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。

121、术语“突变蛋白”或“突变型蛋白”指的是这样的蛋白质，其与亲本蛋白质的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的取代、插入、缺失和/或添加。

122、本发明中，氨基酸残基可以用单字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸(ala，a)，缬氨酸(val，v)，甘氨酸(gly，g)，亮氨酸(leu，l)，谷酰胺酸(gln，q)，苯丙氨酸(phe，f)，色氨酸(trp，w)，酪氨酸(tyr，y)，天冬氨酸(asp，d)，天冬酰胺(asn，n)，谷氨酸(glu，e)，赖氨酸(lys，k)，甲硫氨酸(met，m)，丝氨酸(ser，s)，苏氨酸(thr，t)，半胱氨酸(cys，c)，脯氨酸(pro，p)，异亮氨酸(ile，i)，组氨酸(his，h)，精氨酸(arg，r)。

123、术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括dna、rna或者其杂交体，可以是双链或单链的。

124、如本文中所使用的，术语“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调节元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。

125、在本发明中，“宿主生物”应理解为可以引入突变型als蛋白编码核酸的任何单细胞或多细胞生物，包括例如细菌如大肠杆菌，真菌如酵母(例如酿酒酵母)、霉菌(例如曲霉菌)，植物细胞和植物等。

126、术语“调控元件”又称“调节元件”，如本文中所使用的，旨在包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、内部核糖体进入位点(ires)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚u序列)，其详细描述可参考戈德尔(goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(gene expressiontechnology:methods in enzymology)185，学术出版社(academic press)，圣地亚哥(sandiego)，加利福尼亚州(1990)。在某些情况下，调控元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。在某些情况下，调控元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在某些情况下，术语“调控元件”涵盖的是增强子元件，如wpre；cmv增强子；在htlv-i的ltr中的r-u5’片段((mol.cell.biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；sv40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(proc.natl.acad.sci.usa.，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。

127、如本文中所使用的，术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。组成型(constitutive)启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。诱导型启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其导致所述基因产物在细胞内产生。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。

128、“核定位信号”或“核定位序列”(nls)是对蛋白质“加标签”以通过核转运导入细胞核的氨基酸序列，即，具有nls的蛋白质被转运至细胞核。典型地，nls包含暴露在蛋白质表面的带正电荷的lys或arg残基。示例性核定位序列包括但不限于来自以下的nls：sv40大t抗原，egl-13，c-myc以及tus蛋白。

129、术语“载体”是包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。其通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是双链dna的形式。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员众所周知的用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。

130、术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、工业大麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearing tree)、以及灌木和其他苗木。

131、术语“不想要的植物”理解为影响所需植物(如农作物)正常生长的、没有实用或应用价值的植物，可以包括杂草，例如双子叶和单子叶杂草。双子叶杂草包括，但不限于以下属的杂草：白芥属(sinapis)、独行菜属(lepidium)、拉拉藤galium)、繁缕属(stellaria)、母菊属(matricaria)、春黄菊属(anthemis)、牛膝菊属(galinsoga)、藜属(chenopodium)、荨麻属(urtica)、千里光属(senecio)、苋属(amaranthus)、马齿苋属(portulaca)、苍耳属(xanthium)、旋花属(convolvulus)、番薯属(ipomoea)、蓼属(polygonum)、田菁属(sesbania)、豚草属(ambrosia)、蓟属(cirsium)、飞廉属(carduus)、苦苣菜属(sonchus)、茄属(solanum)、蔊菜属(rorippa)、节节菜属(rotala)、母草属(lindernia)、野芝麻属(lamium)、婆婆纳属(veronica)、苘麻属(abutilon)、三棘果属(emex)、曼陀罗属(datura)、堇菜属(viola)、鼬瓣花属(galeopsis)、罂粟属(papaver)、矢车菊属(centaurea)、车轴草属(trifolium)、毛莨属(ranunculus)和蒲公英属(taraxacum)。单子叶杂草包括，但不限于以下属的杂草：稗属(echinochloa)、狗尾草属(setaria)、黍属(panicum)、马唐属(digitaria)、梯牧草属(phleum)、早熟禾属(poa)、羊茅属(festuca)、穇属(eleusine)、臂形草属(brachiaria)、黑麦草属(lolium)、雀麦属(bromus)、燕麦属(avena)、莎草属(cyperus)、高粱属(sorghum)、冰草属(agropyron)、狗牙根属(cynodon)、雨久花属(monochoria)、飘拂草属(fimbristyslis)、慈姑属(sagittaria)、荸荠属(eleocharis)、藨草属(scirpus)、雀稗属(paspalum)、鸭嘴草属(ischaemum)、尖瓣花属(sphenoclea)、龙爪茅属(dactyloctenium)、剪股颖属(agrostis)、看麦娘属(alopecurus)和阿披拉草属(apera)。所述的不想要植物还可以包括与所要栽培植物不同的其他植物，例如在大豆栽培地自然生长的部分或少量大豆等作物。

132、在本发明中，术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。

133、在本发明中，“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。

134、在本发明中，术语“基因编辑”技术包括crispr技术、talen技术、zfn技术。crispr技术中所指基因编辑工具包括guiderna、cas蛋白(如cas9、cpf1、cas12b等)。talen技术中所指的基因编辑工具是可以切割特定dna序列的限制酶，其包括一个tal效应子dna结合结构域和一个dna切割结构域。zfn技术中所指的基因编辑工具也是可以切割特定dna序列的限制酶，其包括一个锌指dna结合结构域与一个dna切割结构域。本领域技术人员熟知，将编码基因编辑工具的核苷酸及其他调控元件构建于适宜的载体中，再转化细胞，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除、插入、碱基编辑。

135、在本发明中，术语“最大耐受浓度”是指在施用除草剂的情况下，乙酰乳酸合成酶(als)仍能基本保持其催化活性和/或不影响植物正常生长时所能承受的除草剂浓度。

136、术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。因此，本发明的组合物和方法还包含本发明的核苷酸序列和多肽序列的同源物。可以通过包括但不限于以下的已知方法计算“同源性”：computational molecular biology[计算分子生物学](lesk,a.m.编辑)oxford university press[牛津大学出版社],纽约(1988)；biocomputing:informatics and genome projects[生物运算：信息学和基因组项目](smith,d.w.编辑)academic press[学术出版社],纽约(1993)；computer analysis ofsequence data,part i[序列数据的计算机分析，第i部分](griffin,a.m.和griffin,h.g.编辑)humana press[胡马纳出版社],新泽西州(1994)；sequence analysis in molecularbiology[分子生物学中的序列分析](von heinje,g.编辑)academic press[学术出版社](1987)；以及sequence analysis primer[序列分析引物](gribskov,m.和devereux,j.编辑)stockton press[斯托克顿出版社],纽约(1991)。

137、本发明所述蛋白质内的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标蛋白质的氨基酸序列与seq id no.1或seq id no.2进行比对而确定的，譬如用smith-waterman运算法则或用clustalw2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照wilbur,w.j.and lipman,d.j.(1983)rapid similaritysearches ofnucleic acid and protein data banks.proc.natl.acad.sci.usa,80:726-730中所述的方法进行计算。在clustalw2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝gonnet；蛋白质/dna端隙＝-1；蛋白质/dnagapdist＝4。优选采用alignx程序(vectornti组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分:10og缺口延伸罚分0.05)通过将蛋白质的氨基酸序列与seqid no.1或seq id no.2进行比对来确定本发明所述蛋白质内特定氨基酸的位置。

138、应理解，本发明突变蛋白中的氨基酸编号基于seq id no.1或seq id no.2作出，当某一具体突变蛋白与seq id no.1或seq id no.2所示序列的同源性达到70％或以上时，突变蛋白的氨基酸编号可能会有相对于seq id no.1的氨基酸编号的错位，如向氨基酸的n末端或c末端错位1-5位，而采用本领域常规的序列比对技术，本领域技术人员通常可以理解这样的错位是在合理范围内的，且不应当认为由于氨基酸编号的错位而使同源性达80％(如90％、95％、98％)的、具有相同或相似的除草剂耐受活性的突变蛋白不在本发明突变蛋白的范围内。

139、在本发明中，亲本乙酰乳酸合成酶(als)蛋白可以来源于任何植物，特别是前述单子叶或双子叶植物。现有技术文献中已经公开了一些来源的亲本(如野生型)乙酰乳酸合成酶蛋白序列以及编码序列，这些现有技术文献在此引入本文作为参考。

140、优选地，本发明的亲本乙酰乳酸合成酶(als)蛋白来源于大豆。更优选地，所述亲本乙酰乳酸合成酶蛋白具有seq id no.1或seq id no.2所示的氨基酸序列，或者与seq idno.1或seq id no.2所示氨基酸序列有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。

141、本发明还包括所述突变多肽(蛋白)还包括其活性片段、变体、衍生物和类似物包括以下所述的蛋白的任何取代、突变或修饰所产生的物质。

142、本发明的主要优点：

143、本发明筛选出了一种对als抑制剂类除草剂具有较高抗性的als突变多肽，可以用于制备对als抑制剂类除草剂具有抗性或耐受的植物。