柑橘木虱DcVD基因在防控柑橘木虱中的应用

本发明属于生物基因工程，具体涉及一种柑橘木虱dcvd基因在防控柑橘木虱中的应用。

背景技术：

1、柑橘黄龙病(citrus huanglongbing，hlb)是柑橘的“癌症”，可导致果实着色异常、果小畸形，叶片黄化变小，病根表皮易脱离、腐烂等症状，赣南脐橙是江西赣州的特色产品，其种植饱受柑橘黄龙病的困扰。黄龙病在田间主要传播媒介是半翅目木虱科的柑橘木虱(diaphorina citri kuwayama)，黄龙病目前尚无药物根治，因此防控黄龙病的重点在于防治柑橘木虱。柑橘木虱属于不完全变态昆虫，它的一生会经历卵、若虫和成虫3个阶段，一般群聚在嫩叶、幼芽或新梢等部位取食，从而会使柑橘的幼嫩部位凋零萎蔫，而且其产生的白色蜜露会粘附在叶片上，从而导致煤烟病的发生，使植物的光合作用受到影响。

2、柑橘木虱主要依靠化学防治，常用的药剂包括噻虫嗪、螺虫乙酯、噻虫胺等，频繁地使用化学杀虫剂进行防治导致生态环境污染、木虱抗药性增强、果园生物多样性降低等一系列问题，柑橘木虱的防治亟需新的方法。rna干扰技术(rna interference，rnai)是害虫防控的新兴技术，该方法主要是通过短发夹rna或双链小rna对靶标mrna的特异性降解或调控其表达，使得相应靶基因沉默、生物体正常功能被扰乱，从而导致生物体发育异常甚至死亡。利用该方法防治柑橘木虱的前提是筛选高效的rnai防控靶标，这对柑橘木虱绿色防控技术的开发具有重要意义。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提供一种柑橘木虱dcvd基因在防治柑橘黄龙病中的应用。测定了dcvd基因沉默对木虱存活的影响，实验结果表明：dcvd基因沉默后，柑橘木虱的死亡率显著增加，对于柑橘木虱防治以及抗木虱植物的培育具有重大价值。

2、为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明目的之一是提供一种柑橘木虱dcvd基因在防控柑橘木虱中的应用，所述柑橘木虱dcvd基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，seq id no.1具体如下：

4、atgtcaggtaaagagagactacccatattcccttcccgaggagctcagtcactcatgaaatctcgtctgaagggagctcagaagggacacagtcttctcaagaagaaggctgatgctctacagatgaggttccgaatgattctcagcaagattattgagactaaaactctcatgggagaggtaatgaaagaagctgcgttctctctagcagaggccaagttcactactggagatttcaaccaggtagttctacaaaatgtcaccaaggcacagatcaaaatccgcactaagaaagacaatgtagcaggtgttactctacccgtgtttgagagctatcaagatggcacagacacttacgaactggctggtctagctaggggtggacagcagctggcaaagctgaagaaaaattaccagacagctataaaactcctcgtagaacttgcttcactgcaaacgtcatttgtaacattagatgatgtcatcaaaattactaatcggagagtaaatgccatcgagcatgtcattattcctcgcattgaaaagacactagcatacattatttctgagcttgatgagttggaaagagaagagttctaccgtttgaagaaaattcaagacaagaagaaggtgatcaaagcagcttctgaagctttcaggaagtctcgtaaatatgatgaagaacaggcattcaatatgctagaagaggaagatcaggacattttattctag。

5、进一步地，所述应用具体操作步骤如下：合成柑橘木虱dcvd基因的dsrna，稀释合成的dsrna，通过浸泡柑橘木虱若虫的方式将dsrna递送至柑橘木虱体内，即实现杀死柑橘木虱的目的。

6、进一步地，所述dsrna稀释后的浓度为50～150ng/μl，浸泡时间为3～8min。

7、在一些具体实施例中，优选的，所述dsrna稀释后的浓度为100ng/μl，浸泡时间为5min。

8、进一步地，所述扩增引物如下：

9、dcvd f:5’-atgtcaggtaaagagaga-3’；

10、dcvd r:5’-ctagaataaaatgtcctg-3’。

11、进一步地，所述含启动子的引物如下：

12、dcvd-t7 f:5’-taatacgactcactatagggagagactaccc atattcccttc-3’，

13、dcvd-t7 r:5’-taatacgactcactatagggctcgatggcatt tactctccga-3’。

14、本发明目的之二是提供一种生物杀虫制剂，所述生物杀虫制剂包含柑橘木虱dcvd基因的dsrna。

15、进一步地，所述dsrna一条链的核苷酸序列seq id no.2具体如下所示：

16、agagactacccatattcccttcccgaggagctcagtcactcatgaaatctcgtctgaagggagctcagaagggacacagtcttctcaagaagaaggctgatgctctacagatgaggttccgaatgattctcagcaagattattgagactaaaactctcatgggagaggtaatgaaagaagctgcgttctctctagcagaggccaagttcactactggagatttcaaccaggtagttctacaaaatgtcaccaaggcacagatcaaaatccgcactaagaaagacaatgtagcaggtgttactctacccgtgtttgagagctatcaagatggcacagacacttacgaactggctggtctagctaggggtggacagcagctggcaaagctgaagaaaaattaccagacagctataaaactcctcgtagaacttgcttcactgcaaacgtcatttgtaacattagatgatgtcatcaaaattactaatcggagagtaaatgccatcgag。

17、本发明目的之三是提供一种柑橘木虱dcvd基因在培育抗柑橘木虱柑橘品种中的应用。

18、本发明的有益效果为：

19、本发明将dcvd dsrna通过浸泡的方式导入木虱体内，测定了dcvd基因沉默对木虱存活的影响，实验结果表明dcvd基因沉默后，柑橘木虱的死亡率与对照gfp dsrna相比显著增加，浸泡过dcvd dsrna后96h内累积死亡率达到41％；本发明的浸泡方式导入对于制备成相应的杀虫剂而言具有明显优势，综合其灭杀效果，dcvd基因对于柑橘木虱防治以及抗木虱植物的培育具有重大价值。