一种密蒙花多糖、其制备方法及用途

本发明属于多糖领域，具体涉及一种从密蒙花(buddleja officinalis.maxim.)中提取得到的多糖，以及该多糖的制备方法和用途。

背景技术：

1、肝纤维化是多种慢性肝病的共同病变过程。保守统计全球有15亿人患有慢性肝病，使得肝纤维化成为全球负担。当肝组织反复或持续受到损伤时，肝实质会发生瘢痕反应，形成肝纤维化。研究表明及时干预肝纤维化过程似乎是可逆的，虽然对肝纤维化的细胞和分子机制的认识有了很大的进展，但目前还没有安全的治疗肝纤维化的特效药。因此，迫切需要筛选出安全无毒的物质，发挥治疗或预防肝纤维化的潜在效用。

2、密蒙花(buddleja officinalis maxim.)是马钱科醉鱼草属的灌木植物，它作为传统中药和茶饮在中国有着悠久的应用历史。此外，较高的色素含量也使其常用作纺织品的天然染料和烹饪中的食用色素。密蒙花性微寒、味甘，归肝经，用于目赤肿痛，多泪羞明，眼生翳膜，肝虚目暗，视物昏花。密蒙花始载于《开宝本草》，具有清热泻火，养肝明目、退翳的功效。据报道密蒙花的主要成分包括多糖、黄酮类、苯乙醇苷类和萜类化合物。

技术实现思路

1、本发明用一种简单有效的提取和纯化植物多糖的工艺和方法，以密蒙花为原料获得了一种混合多糖组分，并进一步纯化获得了均一的多糖bom0.05s2。药理实验表明多糖bom0.05s2可以显著地降低血清中的谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)，肝脏中的层粘连蛋白(ln)、透明质酸酶(ha)、iii型前胶原(pc-iii)、四型胶原(iv-c)等指标；此外，多糖bom0.05s2可以显著地减少肝脏中胶原纤维的沉积以及肝组织α-sma蛋白的表达；进一步地，发现多糖bom0.05s2可以富集肠道嗜黏蛋白阿克曼菌(akkermansia muciniphila)。

2、基于此，本发明的目的是提供一种密蒙花多糖bom0.05s2、其制备方法及其在制备用于预防和/或治疗肝纤维化，以及与肠道嗜粘蛋白阿克曼氏菌(akkermansiamuciniphila)相关的疾病的药物中的用途。

3、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

4、第一个方面，本发明提供一种密蒙花多糖bom0.05s2，以多糖所包含的所有单糖总摩尔量为100％计，其单糖组成包括40～50％的半乳糖、20～40％的阿拉伯糖、1～10％的葡萄糖、1～10％的甘露糖、1～10％的鼠李糖、1～10％的半乳糖醛酸和1～10％的葡萄糖醛酸。

5、进一步优选地，所述密蒙花多糖bom0.05s2的单糖组成包括半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，以多糖所包含的所有单糖总摩尔量为100％计，其比例依次为47.94％、29.12％、7.85％、7.64％、3.61％、2.20％和1.64％。

6、具体地，所述密蒙花多糖bom0.05s2的结构包括1条主链和4条支链，其中：

7、主链主要由1,4-α-gala、1，2,4-α-rha、1，4-α-glca、1，4-α-glc、1，4,6-α-glc、1，4-β-man和末端-β-gal组成；

8、4条支链及与主链的连接方式分别如下：

9、支链1：由1，4-β-gal和t-α-ara组成，且由1，4-β-gal连接主链1,2,4-α-rha的c-4；

10、支链2：由t-α-ara、1，5-α-ara和1，3，5-α-ara组成，且由1，5-α-ara连接主链1,2,4-α-rha的c-4；

11、支链3：由交替连接的1,3,6-β-gal与1，6-β-gal组成，t-α-ara与t-β-man进一步连接该支链3中1,3,6-β-gal的c-3，且该支链3由1,3,6-β-gal连接主链1,2,4-α-rha的c-4；

12、支链4：由t-α-glc组成，连接到主链1,4,6-α-glc的c-6。

13、进一步地，所述密蒙花多糖bom0.05s2的分子量范围为3～30kda，优选为10～20kda，更进一步优选为13.6kda。

14、第二个方面，本发明提供第一个方面所述的密蒙花多糖bom0.05s2的制备方法，其包括如下步骤：

15、(1)多糖提取：将密蒙花用沸水提取，得到提取液；浓缩所述提取液，所得浓缩液加入乙醇水溶液进行醇沉后，静置，分离得到沉淀物，干燥得密蒙花粗多糖bom；

16、(2)多糖纯化：

17、(i)将步骤(1)得到的密蒙花粗多糖bom在水中溶解后离心，取上清液，利用阴离子交换柱进行初步纯化，依次使用水和0.05m nacl水溶液进行洗脱，收集0.05m nacl水溶液的洗脱组分，得到密蒙花多糖组分bom0.05；

18、(ii)将步骤(i)得到的密蒙花多糖组分bom0.05在水中溶解后离心，取上清液经凝胶柱纯化，得到所述密蒙花多糖bom0.05s2。

19、优选地，步骤(1)中，在进行沸水提取前，先用乙醇水溶液(例如体积分数为80～98％，例如95％的乙醇水溶液)对密蒙花浸泡3～10天(比如7天)，然后干燥(例如，风干)。

20、优选地，步骤(1)中，在所述沸水提取中，密蒙花的重量/水的体积的比例为1∶10～20，优选为1∶12～14，单位：kg/l；沸水提取次数为3～10次，优选为8次，每次3～5小时，优选为4小时。

21、优选地，步骤(1)中，浓缩所述提取液至未浓缩前体积的1/40～1/25，优选为1/40。

22、优选地，步骤(1)中，所述乙醇水溶液的体积分数为80～98％，优选为95％；醇沉所用的乙醇水溶液体积为浓缩液的3～6倍，例如4倍。

23、优选地，步骤(1)中，在对浓缩液进行醇沉前，先对浓缩液进行离心，然后将离心上清液在水中进行透析，透析时间为24～72h；之后透析内液再加入所述乙醇水溶液进行醇沉。

24、优选地，步骤(1)中，所述静置的时间为6～24h，例如12h。

25、优选地，步骤(1)得到的密蒙花粗多糖bom在进行步骤(2)的多糖纯化前进行洗涤后干燥，可以采用乙醇和丙酮交替洗，各洗涤2～4次。

26、优选地，步骤(i)中，在所述溶解过程中，密蒙花粗多糖bom的重量与水的体积比为1：2～20，例如1：10，单位：g/ml。

27、优选地，步骤(i)中，所述阴离子交换柱选自以下型号：deae sepharosetm fastflow、deae cellucose-52，优选deae sepharosetm fast flow。

28、优选地，步骤(i)还包括将收集的0.05m nacl水溶液的洗脱组分进行浓缩、在水中透析、干燥，得到所述密蒙花多糖组分bom0.05。

29、优选地，步骤(ii)中，在所述溶解过程中，密蒙花粗多糖bom与水的用量比为1∶10～30，例如1∶20，单位g/ml。

30、优选地，步骤(ii)中，所述凝胶柱选自以下型号：sephacryl s-200hr、sephacryls-300hr、sephadex g-100和sephadex g-150，优选sephacryl s-200hr。

31、优选地，步骤(ii)中，所述上清液经凝胶柱纯化所用的洗脱液为0.2m nacl水溶液。

32、优选地，步骤(ii)还包括收集得到的洗脱组分经干燥(例如冷冻干燥)得到密蒙花多糖bom0.05s2。

33、第三个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含第一方面所述的密蒙花多糖bom0.05s2或第二方面所述的制备方法制备得到的密蒙花多糖bom0.05s2，以及药学上可接受的辅料。

34、第四个方面，本发明提供第一方面所述的密蒙花多糖bom0.05s2、第二方面所述的制备方法制备得到的密蒙花多糖bom0.05s2，或第三方面所述的药物组合物在制备具有以下一种或多种作用的药物、试剂、膳食或营养补充剂中的用途：

35、a.改善血清中的谷草转氨酶(ast)和/或谷丙转氨酶(alt)水平；

36、b.降低肝脏中的层粘连蛋白(ln)、透明质酸酶(ha)、iii型前胶原(pc-iii)和/或四型胶原(iv-c)；

37、c.抑制胶原纤维在肝组织的沉积；

38、d.富集肠道嗜黏蛋白阿克曼菌(akkermansia muciniphila)。

39、其中，用途a中，改善是指降低肝损伤引起的谷草转氨酶(ast)和/或谷丙转氨酶(alt)水平；进一步地，肝损伤可以由慢性肝纤维化引起。

40、第五个方面，本发明提供第一方面所述的密蒙花多糖bom0.05s2、第二方面所述的制备方法制备得到的密蒙花多糖bom0.05s2，或第三方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肝纤维化和/或肝损伤的药物中的用途。

41、在具体实施方式中，所述肝纤维化与肠道中的嗜粘蛋白阿克曼氏菌相关。

42、第六个方面，本发明提供第一方面所述的密蒙花多糖bom0.05s2、第二方面所述的制备方法制备得到的密蒙花多糖bom0.05s2，或第三方面所述的药物组合物在制备用于治疗与肠道嗜粘蛋白阿克曼氏菌(akkermansia muciniphila)相关的疾病的药物中的用途。

43、所述与肠道嗜粘蛋白阿克曼氏菌(akkermansia muciniphila)相关的疾病包括但不限于炎症性肠病、肥胖、糖尿病、脂肪肝、肝纤维化等。

44、有益效果：

45、本发明从密蒙花中提取纯化得到的密蒙花多糖bom0.05s2可以显著降低血清中的ast、alt，肝脏中的ln、ha、pc-iii、iv-c等指标；此外，多糖bom0.05s2可以显著减少肝脏中胶原纤维的沉积以及肝组织α-sma蛋白的表达；并显著性的富集肠道内的嗜黏蛋白阿克曼菌(akkermansia muciniphila)，进而发挥抗肝纤维化的作用，因此，有望被开发为用于预防/治疗肝纤维化、肝损伤或与肠道嗜粘蛋白阿克曼氏菌相关的其他疾病的药物。