一种重组弹性蛋白及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物，涉及一种重组弹性蛋白及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞外基质是构成细胞外微环境的主要成分，在组织稳态、生长和成熟中发挥着重要作用。同时，在细胞成分与周围微环境相互作用的过程中整合了许多细胞进程，如黏附、生存、迁移、形态、增殖和分化等。

2、多肽类或蛋白类是性能优越的新型载体材料，在药物靶向运输，尤其是抗肿瘤药物的靶向运输和定点释放方面取得良好的研究结果。由于多肽分子链较短，单分子药物负载能力较弱，已有多肽载药均通过多肽的多级组装形成较大的药物负载复合物来实现。长肽或蛋白质较多肽具有更长的分子链，单分子药物负载能力高于多肽，且具有更加丰富多变的组装形式，其材料学性能更为优越。但长肽和蛋白质无法通过化学方法获得，因此在获取方法限制的情况下，长肽和蛋白质相关生物医学应用研究报道较少。

3、目前，市场上具有改善皮肤皱纹和保持皮肤弹性，减少皮肤发炎与过敏风险等功效的产品种类繁多，其有效作用成分包括抗生素、杀菌剂以及中药等。抗生素会对皮肤免疫系统产生影响，导致皮肤脆弱敏感；杀菌剂会破坏皮肤的微生态系统；中药类产品的效果相对温和，但是见效慢，治疗周期长。

4、cn112876569a公开了一种rhtsg6-fnⅲ1-c融合蛋白及其在皮肤护理组合物中的用途和其制备方法，通过优化目的基因序列中稀有密码子，构建重组表达载体和rhtsg6-fnⅲ1-c融合蛋白重组工程菌，重组工程菌经发酵罐发酵、菌体破碎，分离rhtsg6-fnⅲ1-c融合蛋白包涵体，rhtsg6-fnⅲ1-c融合蛋白包涵体经洗涤、变性、复性和亲和层析纯化，制备rhtsg6-fnⅲ1-c融合蛋白原液。

5、因此，亟需提供一种能够有效降低蛋白质的降解率，保证蛋白质的稳定性和生物活性，得到的重组弹性蛋白抗氧化活性更高的弹性蛋白制备方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种重组弹性蛋白及其制备方法和应用，本发明的制备方法得到的重组弹性蛋白能够有效降低蛋白质的降解率，保证蛋白质的稳定性和生物活性，得到的重组弹性蛋白抗氧化活性更高，能够有效促进细胞增殖，促进胶原蛋白和纤连蛋白的表达，抑制基质金属蛋白酶表达。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种制备重组弹性蛋白的方法，所述制备重组弹性蛋白的方法包括：将表达重组弹性蛋白的工程菌培养液接种于发酵罐进行发酵和诱导，诱导后收集菌体使用重悬剂进行重悬，重悬后进行均质，使用中空纤维超滤膜进行过滤，使用中空纤维超滤膜进行浓缩，浓缩后进行纯化和脱盐。

4、本发明的制备方法得到的重组弹性蛋白能够有效降低蛋白质的降解率，保证蛋白质的稳定性和生物活性，得到的重组弹性蛋白抗氧化活性更高，能够有效促进细胞增殖，促进胶原蛋白和纤连蛋白的表达，抑制基质金属蛋白酶表达。

5、优选地，所述发酵罐的罐内压力为0.04-0.10mpa(例如0.04mpa、0.06mpa、0.08mpa、0.1mpa)，所述发酵罐的罐内溶氧量为发酵罐体积的25％-35％(例如25％、30％、35％)。

6、优选地，所述发酵的温度为35-37℃(例如35℃、36℃、37℃)。

7、优选地，所述发酵的转速为130-180rpm(例如130rpm、150rpm、180rpm)，当溶氧低于30％时，调整所述发酵的转速至200-240rpm(例如200rpm、220rpm、240rpm)。

8、优选地，所述发酵罐的罐内空气流量为10-20l/h(例如10l/h、15l/h、20l/h)。

9、优选地，所述发酵的时间为6-10h(例如6h、8h、10h)。

10、优选地，所述诱导包括：当工程菌发酵液的od600值≥3.0时，向发酵罐添加异丙基-β-d-硫代半乳糖苷至异丙基-β-d-硫代半乳糖苷的终浓度为0.1-1mm(例如0.1mm、0.5mm、1mm)。

11、优选地，所述诱导的时间为2-6h(例如2h、4h、6h)，温度为26-30℃(例如26℃、28℃、30℃)，转速为50-100rpm(例如50rpm、80rpm、100rpm)。

12、优选地，所述菌体和重悬剂的体积比为1:(8-12)。

13、优选地，所述重悬剂含有：tris-hcl、nacl和甘油。

14、本发明中，破碎菌体的重悬剂加入5％甘油，有助于蛋白溶出，促进蛋白溶解性。

15、优选地，所述重悬剂中tris-hcl的浓度为40-60mmol/l(例如40mmol/l、50mmol/l、60mmol/l)，ph为7.8-8.2(例如7.8、8.0、8.2)。

16、优选地，所述重悬剂中nacl的浓度为40-60mmol/l(例如40mmol/l、50mmol/l、60mmol/l)。

17、优选地，所述重悬剂中甘油的质量百分比为4-6％(例如4％、5％、6％)。

18、优选地，所述均质包括：100-200mpa(例如100mpa、150mpa、200mpa)均质1次，600-1000mpa(例如600mpa、800mpa、1000mpa)均质2-3次，均质的温度为3-5℃(例如3℃、4℃、5℃)。

19、优选地，所述过滤使用的中空纤维超滤膜的孔径为0.45μm。

20、优选地，所述过滤的温度为3-5℃(例如3℃、4℃、5℃)。

21、优选地，所述浓缩使用的中空纤维超滤膜的孔径为3000-5000道尔顿(例如3000道尔顿、4000道尔顿、5000道尔顿)。

22、优选地，所述浓缩的倍数为2-3倍。

23、本发明中浓缩步骤能够节省层析纯化过程的时间，更大程度保护蛋白不被降解。浓缩程度若大于3倍，会吸附在中空纤维超滤膜上，造成蛋白损失。

24、优选地，所述浓缩的温度为3-5℃(例如3℃、4℃、5℃)。

25、优选地，所述纯化包括将浓缩后的液体以20-30ml/min(例如20ml/min、25ml/min、30ml/min)流速上样，缓冲液1洗涤回基线，缓冲液2洗脱杂蛋白，缓冲液3洗脱目的蛋白。

26、优选地，所述缓冲液1含有tris-hcl、nacl和咪唑，所述缓冲液1中tris-hcl的浓度为15-25mmol/l(例如15ml/min、20ml/min、25ml/min)，所述缓冲液1中nacl的浓度为0.1-0.2mol/l(例如0.1mol/l、0.15mol/l、0.2mol/l)，所述缓冲液1中咪唑的浓度为4-6mmol/l(例如4mol/l、5mol/l、6mol/l)。

27、优选地，所述缓冲液2含有tris-hcl、nacl和咪唑，所述缓冲液2中tris-hcl的浓度为15-25mmol/l(例如15mol/l、20mol/l、25mol/l)，所述缓冲液2中nacl的浓度为0.1-0.2mol/l(例如0.1mol/l、0.15mol/l、0.2mol/l)，所述缓冲液2中咪唑的浓度为80-120mmol/l(例如80mol/l、100mol/l、120mol/l)。

28、优选地，所述缓冲液3含有tris-hcl、nacl和咪唑，所述缓冲液3中tris-hcl的浓度为15-25mmol/l(例如15mol/l、20mol/l、25mol/l)，所述缓冲液3中nacl的浓度为0.1-0.2mol/l(例如0.1mol/l、0.15mol/l、0.2mol/l)，所述缓冲液3中咪唑的浓度为250-350mmol/l(例如250mol/l、300mol/l、350mol/l)。

29、优选地，所述缓冲液1、缓冲液2和缓冲液3的ph各自独立地为7.8-8.2(例如7.8、8.0、8.2)。

30、优选地，所述脱盐包括使用流速为15-25ml/min(例如15ml/min、20ml/min、25ml/min)的脱盐缓冲液洗脱纯化后的重组蛋白得到脱盐的重组蛋白。

31、优选地，所述脱盐缓冲液包括磷酸盐和nacl。

32、优选地，所述脱盐缓冲液中磷酸盐的浓度为20-30mm(例如20mm、25mm、30mm)，所述脱盐缓冲液中nacl的浓度为70-80mm(例如70ml/min、75ml/min、80ml/min)。

33、优选地，所述脱盐的重组蛋白使用含有甘油、乙二胺四乙酸二钠和精氨酸。

34、优选地，所述收集管中甘油的体积百分比为10-20％(例如10％、15％、20％)，所述收集管中乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.4-0.6mm(例如0.4mm、0.5mm、0.6mm)，所述收集管中精氨酸的的浓度为0.05-0.2m(例如0.05m、0.1m、0.2m)。

35、第二方面，本发明提供了一种重组弹性蛋白，所述重组弹性蛋白由第一方面所述的制备重组弹性蛋白的方法制备得到。

36、在本发明的一个实施例中，所述重组弹性蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

37、seq id no.1：

38、tvyavtgrgdspassggggsvpgigvpgigvpgkgvpgigvpgigvpgig vpgigvpgkgvpgigvpgigvpgigvpgigvpgkgvpgigvpgigvpgigvpgi gvpgkgvpgigvpgigvpgigvpgigvpgkgvpgigvpgig。

39、氨基酸序列主要由五肽(val-pro-gly-xaa-gly,vpgxg)重复单元串联而成，xaa是除脯氨酸以外的任何一种氨基酸。本发明中的重组弹性蛋白含145aa，分子量为12.45kda，具有良好的生物相容性，能赋予组织以弹性和抗张能力，支持肌肤的弹性。

40、第三方面，本发明提供了第一方面所述的制备重组弹性蛋白的方法在制备抗氧化修复护肤品中的应用。

41、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

42、(1)本发明的制备方法得到的重组弹性蛋白能够有效降低蛋白质的降解率，保证蛋白质的稳定性和生物活性，得到的重组弹性蛋白抗氧化活性更高，能够有效促进细胞增殖，促进胶原蛋白和纤连蛋白的表达，抑制基质金属蛋白酶表达；

43、(2)本发明中破碎菌体的重悬剂中加入甘油，有助于蛋白溶出，促进蛋白溶解性；

44、(3)本发明中采用中空纤维超滤膜进行过滤和浓缩，能够节省层析纯化过程的时间，更大程度保护蛋白不被降解；

45、(4)本发明中在收集管中提前加入甘油、乙二胺四乙酸二钠和精氨酸，甘油保护蛋白稳定性，乙二胺四乙酸二钠保护蛋白不被降解，精氨酸调节蛋白溶液ph，三者协同保证重组弹性蛋白的稳定性和生物活性。