识别人MSLN蛋白的单克隆抗体及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种识别人msln蛋白的单克隆抗体及其制备方法与应用，属于单克隆抗体。

背景技术：

1、间皮素(mesothelin，msln)最初发现是一个能被单克隆抗体k1特异性识别的抗原，从与k1发生反应的hela细胞系基因文库中提取cdna并克隆出了msln基因，由于该基因编码生成的膜结合蛋白主要位于正常间皮细胞表面，故命名为间皮素。间皮素基因位于染色体16p13，间皮素基因msln包含17个外显子，cdna长约2138bp，含有1884bp的开放阅读框，编码628个氨基酸的前体蛋白(69kda)。该前体蛋白可被弗林(furin)蛋白酶水解为两个部分：40kda大小片段的间皮素和31kda大小的分泌片段，称为巨核细胞增强因子(megakaryocyte-potentiating factor，mpf)。msln是40kda的膜结合蛋白，通过糖基化磷脂酰肌醇锚定于细胞膜，其细胞外结构域由区域ⅰ(n末端区域，残基296～390)，区域ⅱ(残基391～486)和区域ⅲ(c末端区域，残基487～598)组成。目前关于msln的生物学功能尚不完全清楚，但是近年来发现msln作为一种肿瘤分化抗原，在恶性间皮瘤、肺癌、食管癌、胰腺癌、宫颈癌以及卵巢癌等恶性肿瘤中呈过度表达，其中msln蛋白在85％至90％的间皮瘤，80％至85％的胰腺癌和60％至65％的肺癌，卵巢癌和胆管癌中有表达，而在正常组织中几乎不表达(仅少量表达在腹膜、心包膜等位置)，使其成为靶向疗法中的优秀靶点。

2、目前以msln为靶点的靶向药物研发有多种，包括癌症疫苗、adc药物、car-t/nk细胞疗法、单抗药物等，总体来看抗体相关类药物居多。市面所用抗体多数靶向msln胞外区域ⅰ(n末端区域，残基296～390)和区域ⅲ(c末端区域，残基487～598)。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明提供了一种针对人msln蛋白的单克隆抗体，此抗体靶向msln胞外区域(非胞外区域ⅰ和区域ⅲ)，特异性良好，可用于靶向抗体类药物或者用于生物检测类实验。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、识别人msln蛋白的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)免疫：利用义翘神州商品化产品13128-h08h1(296aa～580aa)作为免疫原免疫小鼠；

5、(2)检测：于三次免疫后一周取血，利用包被免疫原13128-h08h1(296aa～580aa)进行血清效价elisa检测，以及利用ovcar-3细胞进行流式检测；

6、(3)杂交瘤细胞的获得：选取检测结果最优的1只小鼠进行杂交瘤融合筛选及有限稀释，取免疫后小鼠脾细胞，按1:1比例与sp2/0骨髓瘤细胞混合，利用电融合法进行融合，获得杂交瘤细胞；

7、(4)单克隆抗体的制备和纯化：培养杂交瘤细胞，进行纯化，得识别人msln蛋白的单克隆抗体。

8、进一步地，所述步骤(1)的具体操作方式为：首次免疫将免疫原与等体积的完全弗氏佐剂制成乳化剂，腹部皮下多点注射；间隔2周后，取相同剂量免疫原与等体积不完全弗氏佐剂制成乳化剂，腹部皮下多点注射；再次间隔2周后，取相同剂量免疫原与等体积不完全弗氏佐剂制成乳化剂，腹部皮下多点注射；每只小鼠单次免疫剂量50μg。

9、进一步地，所述步骤(2)中，以小鼠血清1:8000倍稀释时od450-blank大于0.8为效价合格标准，elisa检测的步骤如下：

10、(1)包被：取适量合成蛋白msln(296aa～580aa)、抗原区域ⅰ(296aa～390aa)和抗原区域ⅲ(487aa～605aa)，用包被缓冲液溶解并稀释成5μg/ml，然后用移液器在96孔板每孔中加入100μl，轻拍板子使样品混匀，用保鲜膜封严，4℃下包被过夜；

11、(2)洗板：用洗涤液按300μl/孔洗板1次，扣干酶标板；

12、(3)封闭：用封闭液按300μl/孔封闭酶标板，室温下封闭1h；

13、(4)洗板：用洗涤液按300μl/孔洗板2次，扣干酶标板；

14、(5)加样：将经过梯度稀释的血清样品及样品稀释剂以100μl/孔加样；

15、(6)加二抗：加入检测抗体，以100μl/孔加至96孔板内，室温下共同孵育2h；

16、(7)洗板：用洗涤液按300μl/孔洗板5次，扣干酶标板；

17、(8)显色：以200μl/孔加入显色液室温放置12min；

18、(9)终止与检测：以50μl/孔加入终止液终止反应，而后用酶标仪进行检测，测定波长为450nm。

19、进一步地，所述步骤(2)中，流式检测的步骤如下：

20、(1)细胞重悬：细胞离心弃上清，加入洗液，重悬，400目滤网过滤，离心洗细胞1次，加入适量洗液重悬细胞调整密度至1×107cells/ml，分装至流式管，每管50μl；

21、(2)一抗孵育：加入稀释后小鼠血清，混匀，4℃、避光孵育20min，加入洗液离心洗细胞1次；

22、(3)二抗孵育：加入2μl小鼠二抗，混匀，4℃、避光孵育20min，加入洗液离心洗细胞1次；

23、(4)上机检测：加入50μl洗液重悬细胞，当日上机检测。

24、进一步地，所述步骤(3)的具体操作方式为：取免疫后小鼠脾细胞，按1:1比例与小鼠骨髓瘤细胞混合，利用电融合法进行融合，获得杂交瘤细胞；于融合后第6天、第8天使用hat选择培养基各进行一次细胞换液；于细胞融合后第10天，取主克隆阶段细胞上清进行筛选检测，使用间接elisa方法筛选获得与抗原蛋白结合的阳性主克隆细胞；主克隆经过连续2～3轮有限稀释及相应筛选，直至获得稳定的单克隆细胞株。

25、进一步地，所述步骤(4)中，培养杂交瘤细胞的具体操作方式为：将1ml杂交瘤细胞转入100ml培养瓶中，定期加入一定量的培养基进行细胞扩增，将细胞扩增至所需生产体积。之后加杂交瘤加料液，隔天加料。培养6～8天后收料。

26、进一步地，所述步骤(4)中，纯化的具体操作方式为：使用蛋白a亲和纯化方法对离心后的杂交瘤细胞培养上清进行纯化，收获单克隆抗体。更进一步地，操作步骤如下：

27、(1)根据表达量选取合适规格的蛋白a柱；

28、(2)水平衡：超纯水清洗2cv，将25％乙醇保存液置换掉；

29、(3)平衡层析柱：ac binding+1/5stock buffer平衡10cv；

30、(4)上样：倒入上样；

31、(5)淋洗：淋洗液淋洗5-10cv至蛋白柱平衡；

32、(6)洗脱：ac elution洗脱，前1cv舍弃，收后1.5cv；

33、(7)中和：加入2m tris,ph 8.0中和洗脱抗体；

34、(8)平衡：ac binding平衡5cv至中性；

35、(9)cip清洗：cip清洗5cv以上；

36、(10)冲洗碱：ac binding冲碱，直至出口处ph为中性；

37、(11)保存：25％乙醇平衡2cv，保存柱子。

38、利用上述方法制备得到的识别人msln蛋白的单克隆抗体，可变区vl的核苷酸序列如seq id no.1所示，可变区vh的核苷酸序列如seq id no.2所示，可变区vl的氨基酸序列如seq id no.3所示，可变区vh的氨基酸序列如seq id no.4所示。

39、上述识别人msln蛋白的单克隆抗体在特异性识别间皮素中的应用，在制备特异性识别间皮素的制剂中的应用。

40、本发明的单克隆抗体的制备方法，首先利用义翘神州商品化产品13128-h08h1(296aa～580aa)作为免疫原免疫5只小鼠，免疫后的小鼠进行血清效价检测。利用包被免疫原13128-h08h1(296aa～580aa)进行血清效价elisa检测，以及利用ovcar-3细胞进行流式检测。血清效价elisa和流式检测合格后，选取检测结果最优的1只小鼠进行杂交瘤融合筛选及有限稀释，取免疫后小鼠脾细胞，按1:1比例与sp2/0骨髓瘤细胞混合，利用电融合法进行融合，获得杂交瘤细胞。筛选阳性克隆后通过1～2步有限稀释进行亚克隆化，直至得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并获取抗体可变区序列，获得的单克隆抗体分别进行elisa和流式验证。

41、本发明得到了稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并获取了抗体可变区序列，获得的单克隆抗体具有良好的特异性，可用于靶向抗体类药物或者用于生物检测类实验。