一种敲除mdr基因的芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于生物基因工程，具体涉及一种敲除mdr基因的芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

1、肌苷酸(inosine 5’-monophosphate,imp)又名次黄嘌呤核苷酸或次黄苷酸，英文简称imp，是一种在核糖核酸(rna)中发现的核苷酸。imp属于芳香杂环化合物，由6-羟基嘌呤核的杂环结构，一个核糖基团和一分子磷酸基组成，其化学结构式为：肌苷酸在常温下不稳定，因此一般在-20℃条件下保存。但肌苷酸二钠相对稳定，为无色或白色细结晶性粉末，无臭，含约7.5分子结晶水，不易吸湿，易溶于水，40℃开始失去结晶水，120℃以上成无水物。结晶状态的imp稳定性较好，在水溶液和碱溶液中稳定，但在酸性(ph<4)溶液中稳定性较差，加热易发生降解，微溶于乙醇，在乙醇或者其他有机溶剂中溶解度极小。

2、肌苷酸作为生物合成嘌呤的核心分子，是转变为其他嘌呤核苷酸的底物，也是一种重要的风味物质。imp是畜禽肉中重要的鲜味物质，可作为食品的增鲜剂，若和谷氨酸钠同时当做食品添加剂使用，会使鲜味浓烈数倍。肌苷酸在医学上，也可用作各种白细胞减少症、肝硬化、心脏病类的医治。

3、迄今为止已经发展了几种方法来生产imp，主要包括：①rna破碎和核苷酸提取；②肌苷进行化学磷酸化；③通过发酵的方式生产imp。使用最广泛的方法是第③种通过微生物发酵生产imp，但这种方法不仅要看微生物合成imp的能力，更重要的是评估其把imp分泌到培养基中的能力，因此也存在一定的局限性。

4、主要协同转运蛋白超家族(major facilitator superfamily，mfs)普遍存在于真核生物、细菌与古细菌中，且序列保守。mfs家族可以促进药物分子、核苷酸、多肽及低聚糖等小分子物质的运输。它们不仅参与了物质交换、信号传导等多种生理活动过程，同时还与各种有毒化合物(包括抗生素、杀菌剂等药物和次生代谢物)主动外排导致的抗性密不可分。芽胞杆菌中基因mdr编码mfs超家族转运蛋白，但不确定该蛋白转运物质的方向，也未见有文献报道。因此，本发明展开了这方面的研究，最终发现在芽胞杆菌中敲除基因mdr后，可大幅提高芽胞杆菌的肌苷酸产量。

技术实现思路

1、本发明的目的在于发掘能够通过发酵方式大量产肌苷酸的方法，进而提供一种重组质粒及其在制备肌苷酸上的应用。

2、为达到以上技术目的，本技术采用的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供一种敲除mdr基因的芽孢杆菌，所述敲除mdr基因的芽孢杆菌是通过将敲除载体导入原始芽胞杆菌中敲除mdr基因获得，所述原始芽孢杆菌为解淀粉芽胞杆菌xh7或地衣芽胞杆菌xz3；所述mdr基因在解淀粉芽胞杆菌中编码的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述mdr基因在地衣芽胞杆菌中编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、优选的，在解淀粉芽胞杆菌xh7中敲除的mdr基因序列为seq id no.3所示，在地衣芽胞杆菌xz3中敲除的mdr基因序列为seq id no.4所示。

5、优选的，所述的敲除载体为t2(2)-ori。

6、第二方面，本发明提供第一方面所述的敲除mdr基因的芽孢杆菌的制备方法，包括：

7、步骤1，以解淀粉芽胞杆菌或者地衣芽胞杆菌的基因组dna为模板，分别采用上游同源臂扩增引物对与下游同源臂扩增引物对进行pcr扩增得到上游同源臂片段和下游同源臂片段；

8、步骤2，将所述上游同源臂片段与所述下游同源臂片段连接，得到完整上下游同源臂；

9、步骤3，将基因敲除质粒进行反向pcr扩增得到线性质粒片段；

10、步骤4，将所述完整上下游同源臂和所述线性质粒片段经无缝克隆酶重组，获得重组产物；

11、步骤5，将所述重组产物转入大肠杆菌dh5α中，以卡那霉素为抗性筛选标记，并经过菌落pcr，得到阳性转化子一并提取敲除质粒；

12、步骤6，将所述敲除质粒转入解淀粉芽胞杆菌xh7或地衣芽胞杆菌xz3，以卡那霉素为抗性筛选标记，筛选得到阳性转化子二，进一步通过单双交换同源重组，获得所述敲除mdr基因的芽孢杆菌。

13、优选的，所述步骤1中，以解淀粉芽胞杆菌xh7的基因组dna为模板的上游同源臂扩增引物对序列分别如seq id no.11和seq id no.12所示，所述下游同源臂扩增引物对分别如seq id no.13和seq id no.14所示；优选地，所述上游同源臂片段与所述下游同源臂片段的核苷酸序列如seq id no.5和seq id no.6所示；

14、或者，所述步骤1中，以地衣芽胞杆菌xz3的基因组dna为模板的上游同源臂扩增引物对序列分别如seq id no.21和seq id no.22所示，所述下游同源臂扩增引物对分别如seq id no.23和seq id no.24所示；优选地，所述上游同源臂片段与所述下游同源臂片段的核苷酸序列如seq id no.8和seq id no.9所示。

15、优选的，所述步骤2中，将上游同源臂与下游同源臂通过soe-pcr方式连接；优选地，针对解淀粉芽胞杆菌xh7的soe-pcr方式采用的引物对序列如seq id no.11和seq idno.14所示，获得的完整上下游同源臂序列如seq id no.7所示；

16、或者，针对地衣芽胞杆菌xz3的soe-pcr方式采用的引物对序列如seq id no.19和seq id no.22所示，获得的完整上下游同源臂序列如seq id no.10所示。

17、第三方面，本发明提供第一方面所述的敲除mdr基因的芽孢杆菌在制备肌苷酸中的用途。

18、第四方面，本发明提供一种制备肌苷酸的方法，包括如下步骤：

19、步骤1)，将所述敲除mdr基因的芽孢杆菌进行活化培养，然后再进行种子培养；

20、步骤2)，将种子培养结束的菌液进行发酵培养，得到肌苷酸。

21、优选的，所述活化培养包括：将所述敲除mdr基因的芽孢杆菌以体积百分比1～5％接种于lb培养基中，于200～250r/min、温度37±1℃培养10～15h；和/或，

22、所述种子培养包括：将活化后的菌液以体积百分比按1～5％接种量接种于种子培养基后于200～250r/min、温度37±1℃培养10～15h；

23、进一步优选地，所述种子培养采用的培养基成分组成为：1.0～2.0％胰蛋白胨，0.5～1.0％酵母提取物，0.5～1.0％ nacl，2.5～3.0％葡萄糖，余量为无菌水。

24、优选的，所述发酵培养的控制条件包括：种子培养的菌液按照接种量为2～4％接入发酵培养基，于200～250r/min、温度37±1℃发酵培养70～75h；

25、进一步优选地，所述发酵培养基组成为：0.5％酵母粉，0.08～0.2％柠檬酸钠，1.5～2.0％硫酸铵，0.2～0.3％磷酸二氢钾，0.2～0.3％七水合硫酸镁，0.0004～0.0005％硫酸锰，2～3％葡萄糖，1.5～2.0％碳酸钙，余量为无菌水。

26、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

27、本发明首次通过设计合成一种敲除mdr基因的重组质粒，将该重组质粒转入到芽胞杆菌中来促进肌苷酸生产，为提高肌苷酸产量提供了一种新策略。与解淀粉芽胞杆菌xh7或地衣芽胞杆菌xz3相比，通过本发明构建得到的重组芽胞杆菌xh7△mdr或xz3△mdr的肌苷酸产量至少提高了75.47％以上。