结合CD19的嵌合抗原受体及其用途的制作方法

本发明涉及免疫学和分子生物学领域，特别是嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor,car)修饰的免疫细胞及其用途。

背景技术：

1、嵌合抗原受体t细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor t-cellimmunotherapy，简称car-t)技术结合了抗体的特异性及t细胞的杀伤效应，从而形成了一种过继性免疫的有效途径。最初的car通常由胞外抗原结合域、铰链区、跨膜区和胞内信号域构成。第二代car增加了胞内共刺激域，如cd28,cd137,ox40等，通常位于跨膜区与胞内信号域之间。第三代car使用两个共刺激域，以增强car-t的激活。car-t技术在血液瘤治疗方面取得了巨大成功，尤其是靶向cd19的car-t，但是仍有一些患者无响应或响应后复发，而且在疗效持久性及毒副反应上仍有不足。car-t疗效和安全性的两个重要问题是：1)car-t在体内的扩增和持续不足；2)car-t会引起细胞因子风暴、神经毒性和脱靶效应等毒副反应。

2、car-t细胞对靶细胞的杀伤能力、体内扩增能力和其安全性受多种因素影响，包括car的设计、靶细胞表面的抗原密度、car-t制备工艺等，其中car的设计是关键，需要考虑car的抗原结合结构域与靶点的亲和力、共刺激信号域的组成、以及cd3ξ信号域的组成等。car分子各结构域的设计取决于靶点的特异性、表达丰度、在细胞膜表面的结构特征，以及适应症的病理特征和治疗策略等。

技术实现思路

1、一方面，本发明公开了一种分离的抗原结合结构域，其包括：

2、a)能够结合cd19的单链可变区片段，其包括轻链可变区和重链可变区；

3、b)一个或多个保护性肽，其中所述保护性肽段包含富含极性氨基酸的长度为8-15个氨基酸的多肽，所述保护性肽可操作性连接在所述轻链可变区或重链可变区的n端、c端、或轻链可变区和重链可变区之间；

4、所述保护性肽与轻链可变区或重链可变区之间可选择性地通过富含甘氨酸和丝氨酸的柔性接头肽连接。

5、在一个具体实施方案中，所述轻链可变区包含如seq id no:1所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seq id no:2所示的氨基酸序列。

6、在一个具体实施方案中，所述保护性肽包含选自seq id nos:6、7、8、9或10所示的氨基酸序列或与其具有至少75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的氨基酸序列。

7、在一个实施方案中，所述保护性肽可操作性连接在所述轻链可变区的n端或c端；在一个实施方案中，所述保护性肽可操作性连接在所述重链可变区的n端或c端；在一个实施方案中，所述保护性肽可操作性连接在轻链可变区和重链可变区之间。在一个具体实施例中，所述富含甘氨酸和丝氨酸的柔性接头肽的氨基酸序列可以为(g4s)n，其中n＝1-4，优选所述柔性肽可以为(g4s)2，即ggggsggggs。所述保护性肽与轻链可变区或重链可变区之间可选择性地通过富含甘氨酸和丝氨酸的柔性接头肽例如(g4s)2连接，例如在轻链可变区的n端可操作性连接保护性肽段和柔性接头肽。

8、在一个实施方案中，所述抗原结合结构域包含选自seq id nos:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示的氨基酸序列或与其具有至少75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的氨基酸序列。

9、另一方面，本发明公开了一种分离的嵌合抗原受体，其包括如前所述的抗原结合结构域。

10、在一个实施方案中，所述嵌合抗原受体进一步包括共刺激结构域和/或胞内信号转导结构域。

11、在一个具体实施方案中，所述共刺激结构域选自cd27、cd28、4-1bb、ox-40、cd30、cd40、pd-1、icos、lfa-1、cd-2、cd7、light、nkg2c、b7-h3或其任意组合。在一个具体实施方案中，所述胞内信号转导结构域选自cd3ζ。

12、在一个具体实施方案中，所述共刺激结构域选自4-1bb，优选地，所述4-1bb共刺激结构域包含如seq id no:41所述的氨基酸序列或其变体，所述4-1bb变体包括seq id no:41中的q20f、t21p、t22e、q23e、f32q、p33t、e34t、e35q氨基酸替代的一种或多种或所述变体为seq id no:41所述的氨基酸序列n端或c端连接一段如seq id no:53、54、55所述的氨基酸序列。

13、在一个具体实施方案中，所述4-1bb共刺激结构域包含如seq id no:41所示氨基酸序列的变体，优选地，所述4-1bb变体至少包括q20f氨基酸替代，进一步包括t21p和q23e；在一个具体实施例中，所述变体包括seq id no:41中的q20f氨基酸替代；在一个具体实施例中，所述变体包括seq id no:41中的q20f、t21p和q23e氨基酸替代；在一个具体实施例中，所述变体包括seq id no:41中的q20f、t21p、t22e、q23e、f32q、p33t、e34t、e35q氨基酸替代。

14、在一个具体实施方案中，所述共刺激结构域选自4-1bb，优选地，所述4-1bb共刺激结构域包含如seq id nos:43、45、47、49或51所示的氨基酸序列或与其具有至少75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的氨基酸序列。

15、在一个实施方案中，所述cd3ζ胞内信号转导结构域包含如seq id no:56所述的氨基酸序列或其变体，所述变体包括v2l、d9e、q14k、q15k、y90f、l104y、h105r、m106h中的一种或多种。在一个具体实施例中，所述cd3ζ变体包含q14k氨基酸替代。在一个具体实施例中，所述cd3ζ变体包含q15k氨基酸替代，进一步还可以包含v2l和y90f氨基酸替代，进一步还可以包含d9e，例如在一个具体实施例中，所述cd3ζ变体包含v2l、q15k和y90f氨基酸替代；在一个具体实施例中，所述cd3ζ变体包含v2l、d9e、q15k和y90f氨基酸替代；在一个实施例中，所述cd3ζ变体包含v2l、d9e、q15k、y90f、l104y、h105r和m106h氨基酸替代。

16、在一个具体实施方案中，所述cd3ζ胞内信号转导结构域包含如seq id nos:58、60、62、64或66所示的氨基酸序列或与其具有至少75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的氨基酸序列。

17、在一个实施方案中，所述嵌合抗原受体还可以进一步包括铰链区和跨膜结构域。在一个具体实施例中，所述铰链区和和跨膜结构域选自igg1、igg4、cd8α、cd28、il-2受体、il-7受体、il-11受体、pd-1或cd34的铰链区和跨膜结构域。所述嵌合抗原受体还可以进一步包括信号肽。

18、在一个具体实施方案中，所述嵌合抗原受体包括依次连接的：

19、a)信号肽；

20、b)抗原结合结构域，包含如seq id nos:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37或39所示的氨基酸序列或与其具有至少75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的氨基酸序列；

21、c)诸如cd8α的铰链区和cd8α的跨膜结构域；

22、d)4-1bb共刺激结构域，包含如seq id nos:41、43、45、47、49或51所示的氨基酸序列或与其具有至少75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的氨基酸序列；和

23、e)cd3ζ胞内信号转导结构域，包含如seq id nos:58、60、62、64或66所示的氨基酸序列或与其具有至少75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的氨基酸序列。

24、在一个具体实施方案中，所述嵌合抗原受体包括如seq id no:68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122或124所示的氨基酸序列或与其具有至少75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上同一性的氨基酸序列。

25、又一方面，本发明进一步公开了一种分离的核酸分子，其编码如本发明中所述的抗原结合结构域或所述的嵌合抗原受体。

26、本发明公开了一种载体，其包含如前所述的分离的核酸分子；优选的，其中所述载体选自dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体中的一种或多种。所述载体是表达载体或克隆载体。

27、本发明公开了一种细胞，其包含如前所述的分离的核酸分子或如前所述的载体。

28、在一个实施方案中，所述细胞为t淋巴细胞、b淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、细胞毒性t细胞、肿瘤浸润t细胞或调节性t细胞。在一个具体实施例中，所述细胞选自人外周血t淋巴细胞。

29、本发明公开了一种药物组合物，其包括选自下述的一项或多项：

30、i)如前所述的分离的抗原结合结构域；

31、ii)如前所述的分离的嵌合抗原受体；

32、iii)如前所述的分离的核酸分子；

33、iv)如前所述的载体；和

34、v)如前所述的细胞；

35、以及，药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

36、本发明公开了用于制备如前所述的细胞的方法，其包括：将编码如前所述的嵌合抗原受体的核酸引入所述细胞中。

37、再一方面，本发明还公开了如前所述的抗原结合结构域、嵌合抗原受体、核酸分子、载体、细胞或药物组合物在制备药物中的用途；如前所述的抗原结合结构域、嵌合抗原受体、核酸分子、载体、细胞或药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病优选选自肿瘤、自身免疫病、或病毒或细菌引起的感染性疾病。

38、本发明公开了在患有疾病的受试者中进行细胞免疫治疗的方法，其包括向受试者施用如前所述的药物组合物或如前所述的细胞，其中所述疾病优选选自肿瘤、自身免疫病、或病毒或细菌引起的感染性疾病。

39、在一个实施方案中，所述的肿瘤是肿瘤特异性分子介导的实体瘤或血液学癌症，其中所述实体瘤优选为乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、胃癌、胃肠间质瘤、肺癌和甲状腺癌；其中所述的血液学癌症优选地选自急性白血病，其包括急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病；慢性白血病，其包括慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病和难治疗的cd19+白血病和淋巴瘤；真性红细胞增多症；淋巴瘤；套细胞淋巴瘤；扩散大b-细胞淋巴瘤；霍奇金氏疾病；非霍奇金氏淋巴瘤；多发性骨髓瘤；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；重链疾病；骨髓增生异常综合征；多毛细胞白血病；和脊髓发育不良；其中所述的血液学癌症最优选为急性淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病。其中肿瘤特异性分子为cd19。

40、在一个具体实施方案中，所述的肿瘤是复发的肿瘤或癌症。