一种检测羊草多插入缺失多态性的物质、方法及其应用

本发明属于包含酶、核酸或微生物的测定或检测方法，具体涉及一种检测羊草多插入缺失多态性的物质、方法及其应用。

背景技术：

1、分子标记可以应用于植物种质和品种鉴定以及转基因鉴定等等。dna分子鉴定是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的dna片段自身在物种种内的特异性或种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，它可以对物种或样本进行快速的自动鉴定。

2、羊草(leymus chinensis)，又称碱草，是多年生根茎型植物，隶属禾本科赖草属，主要分布于我国的东北三省及内蒙古自治区等地，俄罗斯、日本和朝鲜也有分布，是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原的重要建种群。羊草品质优良，营养价值高，抗逆性强，适口性好，目前在发展人工草地、改良退化草原方面占重要地位。但是在自然生境中羊草无性繁殖占绝对优势，有性繁殖能力较弱，主要表现在三低问题：即结实率低25％左右、抽穗率低7.9％左右、种子萌发率低(10％-20％)。有性繁殖能力低给羊草的实际生产和应用带来很大的困难，严重限制了羊草的大面积人工栽培。在产业化过程中，植物繁殖种子的能力决定了其实际应用的潜力，只有种子繁殖系数较高的牧草才能被广泛应用。然而羊草的结实率低、发芽率低、育种周期长，长期制约着新品种的开发和利用。面对草牧业快速发展和生态修复(建设)的巨大需求，羊草高结实率新品种的选育迫在眉睫。

3、但是由于羊草是多年生植物，传统杂交育种技术周期长，需要等到2到3年开花结实后，才能确定通过杂交创制的候选材料的结实率，然后进行高结实率羊草新种质的筛选和新品种的选育。因此，迫切需要开发在苗期就可进行快速、高效筛选的分子标记组合并建立相应的低成本、鉴定效率高且精准度高的应用流程。

4、羊草结实性状是多基因控制的有性生殖性状，常规的单一snp标记难以准确的对不同结实率的羊草种质进行区别鉴定；利用分子标记技术分析羊草种质资源的遗传多样性及亲缘关系，是阐明羊草的遗传基础及改良羊草种质资源的基础。近年来，分子标记技术发展迅速，但是由于羊草基因组大、遗传背景复杂，重复序列占比高，目前还没有基于覆盖全基因水平且应用于精准识别研究羊草结实性状的遗传多样性的分子标记。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供能够检测鉴定羊草结实率的物质。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了检测羊草多插入缺失多态性的物质在鉴定或辅助鉴定羊草结实率(鉴别或辅助鉴别羊草的结实率)中的应用，

4、所述物质为由名称分别为indel-1-p、indel-2-p、indel-3-p、indel-4-p、indel-5-p、indel-6-p、indel-7-p、indel-8-p、indel-9-p、indel-10-p、indel-11-p、indel-12-p、indel-13-p、indel4-1-p、indel-15-p、indel-1-p、indel-16-p、indel-17-p、indel-18-p、indel-19-p、indel-20-p、indel-21-p、indel-22-p、indel-23-p、indel-24-p、indel-25-p、indel-26-p、indel-27-p、indel-28-p、indel-29-p和indel-30-p的这30种引物对组成的组合物；

5、所述indel-1-p由核苷酸序列是seq id no.1和seq id no.2的两条单链dna组成；所述indel-2-p由核苷酸序列是seq id no.3和seq id no.4的两条单链dna组成；所述indel-3-p由核苷酸序列是seq id no.5和seq id no.6的两条单链dna组成；所述indel-4-p由核苷酸序列是seq id no.7和seq id no.8的两条单链dna组成；所述indel-5-p由核苷酸序列是seq id no.9和seq id no.10的两条单链dna组成；所述indel-6-p由核苷酸序列是seq id no.11和seq id no.12的两条单链dna组成；所述indel-7-p由核苷酸序列是seqid no.13和seq id no.14的两条单链dna组成；所述indel-8-p由核苷酸序列是seq idno.15和seq id no.16的两条单链dna组成；所述indel-9-p由核苷酸序列是seq id no.17和seq id no.18的两条单链dna组成；所述indel-10-p由核苷酸序列是seq id no.19和seqid no.20的两条单链dna组成；所述indel-11-p由核苷酸序列是seq id no.21和seq idno.22的两条单链dna组成；所述indel-12-p由核苷酸序列是seq id no.23和seq id no.24的两条单链dna组成；所述indel-13-p由核苷酸序列是se q id no.25和seq id no.26的两条单链dna组成；所述indel-14-p由核苷酸序列是seq id no.27和seq id no.28的两条单链dna组成；所述indel-15-p由核苷酸序列是seq id no.29和seq id no.30的两条单链dna组成；所述indel-16-p由核苷酸序列是seq idno.31和seq id no.32的两条单链dna组成；所述indel-17-p由核苷酸序列是seq idno.33和seq id no.34的两条单链dna组成；所述indel-18-p由核苷酸序列是seq id no.35和seq id no.36的两条单链dna组成；所述indel-19-p由核苷酸序列是seq id no.37和seq id no.38的两条单链dna组成；所述indel-20-p由核苷酸序列是seq id no.39和seq id no.40的两条单链dna组成；所述indel-21-p由核苷酸序列是seq id no.41和seq id no.42的两条单链dna组成；所述indel-22-p由核苷酸序列是seq id no.43和seq id no.44的两条单链dna组成；所述indel-23-p由核苷酸序列是seq id no.45和seq id no.46的两条单链dna组成；所述indel-24-p由核苷酸序列是seq id no.47和se q id no.48的两条单链dna组成；所述indel-25-p由核苷酸序列是seq id no.49和seq id no.50的两条单链dna组成；所述indel-26-p由核苷酸序列是seq id no.51和seq id no.52的两条单链dna组成；所述indel-27-p由核苷酸序列是seq id no.53和seq idno.54的两条单链dna组成；所述indel-28-p由核苷酸序列是seq id no.55和seq idno.56的两条单链dna组成；所述indel-29-p由核苷酸序列是seq id no.57和seq id no.58的两条单链dna组成；所述indel-30-p由核苷酸序列是seq id no.59和seq id no.60的两条单链dna组成。

6、所述indel-1-p是检测名称为indel_1的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_1是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc1ns染色体的第236115390位-236115393位的核苷酸序列是5′-ctgt-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-ct-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-ctgt-3′；

7、所述indel-2-p是检测名称为indel_2的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_2是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc1ns染色体的第261464410位-261464412位是5′-tag-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-t-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-tag-3′；

8、所述indel-3-p是检测名称为indel_3的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_3是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc1ns染色体的第295721606位-295721611位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-cgcgag-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-c-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-cgcgag-3′；

9、所述indel-4-p是检测名称为indel_4的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_4是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc2ns染色体的第505186724位-505186727位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-atag-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-atag-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-a-3′；

10、所述indel-5-p是检测名称为indel_6的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_5是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc2ns染色体的第505186723位-505186726位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-cata-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-cata-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-c-3′；

11、所述indel-6-p是检测名称为indel_6的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_6是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc2xm染色体的第567528306位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-t-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-t-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-tcg-3′；

12、所述indel-7-p是检测名称为indel_7的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_7是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc2xm染色体的第567528307位-567528308位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-tg-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-tg-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-tgtcg-3′；

13、所述indel-8-p是检测名称为indel_3的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_3是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc3xm染色体的第156615192位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-g-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-g-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-gaa-3′；

14、所述indel-9-p是检测名称为indel_9的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_9是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc3xm染色体的第200471157位-200471162位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-cgtgtt-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-c-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-cgtgtt-3′；

15、所述indel-10-p是检测名称为indel_10的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_10是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc4ns染色体的第471241350位-471241357位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-gccccccc-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-gccccccc-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-gc-3′；

16、所述indel-11-p是检测名称为indel_11的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_11是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc4ns染色体的第471241352位-471241353位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-tc-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-tcccccgc-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-tc-3′；

17、所述indel-12-p是检测名称为indel_12的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_12是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc4xm染色体的第254641576位-254641578位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-ctt-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-cttgtt-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-ctt-3′；

18、所述indel-13-p是检测名称为indel_13的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_13是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc4xm染色体的第289253984位-289253985位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-ta-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-tctaa-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-taa-3′；

19、所述indel-14-p是检测名称为indel_14的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_14是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc5xm染色体的第58489729位-58489737位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-atttgcatt-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-a-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-atttgcatt-3′；

20、所述indel-15-p是检测名称为indel_15的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_15是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc5xm染色体的第264968596位-264968599位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-caga-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-caga-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-c-3′；

21、所述indel-16-p是检测名称为indel_16的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_16是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc5xm染色体的第316997496位-316997497位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-tt-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-tt-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-ttctct-3′；

22、所述indel-17-p是检测名称为indel_17的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_17是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc5xm染色体的第409910944位-409910947位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-gttt-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-gttt-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-gt-3′；

23、所述indel-18-p是检测名称为indel_18的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_18是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc5xm染色体的第415583994位-415583999位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-aaaggt-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-aaaggt-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-a-3′；

24、所述indel-19-p是检测名称为indel_19的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_19是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc6ns染色体的第288915855位-288915863位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-gaaaccaaa-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-g-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-gaaaccaaa-3′；

25、所述indel-20-p是检测名称为indel_20的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_20是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc6xm染色体的第457382318位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-c-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-c-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-ctca-3′；

26、所述indel-21-p是检测名称为indel_21的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_21是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc7ns染色体的第89988661位-89988663位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-aag-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-aag-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-a-3′；

27、所述indel-22-p是检测名称为indel_22的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_22是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc7ns染色体的第373098439位-373098443位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-ctttt-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-ctt-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-ctttt-3′；

28、所述indel-23-p是检测名称为indel_23的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_23是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc7ns染色体的第379567923位-379567926位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-accc-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-accc-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-acccccc-3′；

29、所述indel-24-p是检测名称为indel_24的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_24是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc7ns染色体的第379567924位-379567927位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-cccg-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-cccg-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-cccgccg-3′；

30、所述indel-25-p是检测名称为indel_25的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_25是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc7ns染色体的第441863628位-441863629位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-ct-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-ctgt-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-ct-3′；

31、所述indel-26-p是检测名称为indel_26的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_26是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc7ns染色体的第556564709位-556564712位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-ccag-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-c-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-ccag-3′；

32、所述indel-27-p是检测名称为indel_27的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_27是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc7xm染色体的第525649946位-525649950位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-gcaac-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-gcaac-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-g-3′；

33、所述indel-28-p是检测名称为indel_28的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_28是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc7xm染色体的第525653482位-525653485位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-tgca-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-tgcagca-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-ctgt-3′；

34、所述indel-29-p是检测名称为indel_29的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_29是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc7xm染色体的第538134266位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-c-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-c-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为5′-ccccaat-3′；

35、所述indel-30-p是检测名称为indel_30的羊草indel分子标记的多态性引物对，所述indel_30是羊草lc1ns染色体上的一个插入缺失标记，其多态性是对应于羊草参考基因组的lc7xm染色体的第567319996位的核苷酸序列是其核苷酸序列为5′-c-3′，高结实材料此位置的核苷酸序列为：5′-c-3′，低结实率材料此位置的核苷酸序列为或5′-cgtt-3′。

36、本发明还提供了鉴定或辅助鉴定羊草结实率(鉴别或辅助鉴别羊草的结实率)的组合物，所述组合物为前述的物质。

37、本发明还提供了一种鉴别或辅助鉴别羊草的结实率的方法，所述方法包括以下步骤：以待鉴别羊草基因组dna为模板，利用前述的组合物中每种引物对分别进行pcr扩增，得到30种引物对的pcr产物，根据30种引物对的pcr产物有无特异条带鉴别羊草的结实率，30种引物对的pcr产物有特异条带的羊草的结实率高于30种引物对的pcr产物无特异条带的羊草，所述30种引物对的pcr产物有特异条带满足下述30个条件：

38、1)indel-1-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；2)indel-2-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；3)indel-3-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；4)indel-4-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；5)indel-5-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；6)indel-6-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；7)indel-7-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；8)indel-8-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；9)indel-9-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；10)indel-10-p引物对的pcr产物含有500-2000bp的条带；11)indel-11-p引物对的pcr产物含有500-2000bp的条带；12)indel-12-p引物对的pcr产物含有500-2000bp的条带；13)indel-13-p引物对的pcr产物含有500-2000bp的条带；14)indel-14-p引物对的pcr产物含有500-2000bp的条带；15)indel-15-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；16)indel-16-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；17)indel-17-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；18)indel-18-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；19)indel-19-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；20)indel-20-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；21)indel-21-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；22)indel-22-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；23)indel-23-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；24)indel-24-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；25)indel-25-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；26)indel-26-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；27)indel-27-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；28)indel-28-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；29)indel-29-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；30)indel-30-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带。

39、所述30种引物对的pcr产物无特异条带为不满足上述30个条件中的至少一个条件。

40、上述方法中，所述pcr扩增的循环中的退火条件为55℃退火30s。

41、上述方法中，所述pcr扩增的循环中延伸条件为72℃延伸60s。

42、本发明还提供了前述物质在羊草的幼苗期鉴定或辅助鉴定是否为高结实率的种质材料或品种中的应用。

43、本发明还提供了前述物质在制备羊草的幼苗期鉴定或辅助鉴定是否为高结实率的种质材料或品种的产品。

44、本发明还提供了前述物质在羊草的幼苗期鉴定或辅助鉴定是否为低结实率的种质材料或品种中的应用。

45、本发明还提供了前述物质在制备羊草的幼苗期鉴定或辅助鉴定是否为低结实率的种质材料或品种的产品中的应用。

46、本发明还提供了前述物质在羊草育种或者羊草育种的产品种中的应用。

47、所述幼苗期为羊草种子萌发后3片真叶期。所述低结实率为结实率低于10％。所述高结实率为结实率高于65％。

48、所述产品可为包含检测所述indel分子标记组合的引物的试剂盒。本发明的试剂盒还包括用于pcr扩增的其它试剂。所述用于pcr扩增的其它试剂可包括buffer缓冲液、dntp、taq酶和ddh2o。

49、本发明还提供了一种羊草育种的方法，所述方法包括以待选择亲本羊草的基因组dna为模板，利用前述组合物中每种引物对分别进行pcr扩增，得到30种引物对的pcr产物，选择30种引物对的pcr产物有特异条带的羊草作为亲本进行育种，所述30种引物对的pcr产物有特异条带满足下述30个条件：

50、1)indel-1-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；；2)indel-2-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；3)indel-3-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；4)indel-4-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；5)indel-5-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；6)indel-6-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；7)indel-7-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；8)indel-8-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；9)indel-9-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；10)indel-10-p引物对的pcr产物含有500-2000bp的条带；11)indel-11-p引物对的pcr产物含有500-2000bp的条带；12)indel-12-p引物对的pcr产物含有500-2000bp的条带；13)indel-13-p引物对的pcr产物含有500-2000bp的条带；14)indel-14-p引物对的pcr产物含有500-2000bp的条带；15)indel-15-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；16)indel-16-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；17)indel-17-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；18)indel-18-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；19)indel-19-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；20)indel-20-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；21)indel-21-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；22)indel-22-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；23)indel-23-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；24)indel-24-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；25)indel-25-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；26)indel-26-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；27)indel-27-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；28)indel-28-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；29)indel-29-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带；；30)indel-30-p引物对的pcr产物含有750-2000bp的条带。

51、上述方法包括如下步骤:(1)提取待鉴定羊草材料dna；(2)利用mip分子标记组合形成的引物对组合对目标区段进行pcr扩增；(3)对深度测序区段进行扩增产物进行电泳检测；(4)将该待鉴定羊草材料的所有indel位点的电泳图谱与预先建立的高结实率和低结实率羊草材料的mip扩增电泳图谱进行比对，从而确定该材的结实率的类型。判断规则：

52、①高结实率材料：以待测样本的基因组dna为模板，indel_1到indel_30共30个indel标记的引物对均能扩增出dna片段，则认为该待测材料为高结实率材料。②非高结实率材料：以待测样本的基因组dna为模板，indel_1到indel_30共30个indel标记中任一个indel的引物对未扩增出dna片段，则认为该待测材料为非高结实率材料。

53、上述所述的方法中，所述pcr反应体系具体如下(总体积为25μl)：dna模板1μl，正向引物和反向引物各1μl，10×buffer 2.5μl，dntp mixture(10mmol/leach)2μl，taq酶(20u/μl)0.25μl，ddh2o 12.25μl。所述正向引物和所述反向引物在反应体系中的终浓度均为5μm。所述pcr反应条件具体如下：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，共36个循环；72℃延伸10min。

54、本发明的优点在于，利用本发明的羊草indel分子标记组合进行羊草的结实率性状鉴定时，采用基于pcr技术，和其它技术相比，具有检测平台的广适性、操作便捷、标记灵活性、检测高效性和信息的可加性等特点，应用前景广阔。面对羊草基因组的复杂性，本发明通过大量实验、对比分析验证，最终获得了数量较少、成本较低的indel分子标记组合，且该分子标记组合可实现羊草结实率性状品种的精准、高效鉴定，有利于育种者用于在幼苗期进行高结实率羊草种质的鉴定和筛选，加速羊草新品种选育。