抗呼吸道合胞病毒中和性抗体及其用途的制作方法

发明领域本技术大体涉及基因工程和抗体药物领域；具体而言，涉及针对呼吸道合胞病毒(rsv)的抗体以及所述抗体在预防或治疗呼吸道合胞病毒(rsv)相关疾病中的用途。

背景技术：

0、发明背景

1、大容量、高质量的抗体库，对于筛选任意抗原的高亲和力抗体提供了重要的分子来源，具有很高的商业和应用价值。目前，国内外报道的优质抗体库，多是通过电转化技术构建而成。然而，利用电转化技术构建的抗体库，库容大小受限于转化效率，需要经过多批次的抗体库制备，周期长，需要耗费大量人力和物力资源。

2、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，rsv)是世界范围内引起5岁以下儿童急性下呼吸道感染(acute lower respiratory tract infections，alrti)最重要的病毒病原1。rsv感染是造成婴幼儿病毒性呼吸道感染住院的首要因素，严重危害儿童健康，尤其对早产儿、患有先天性心脏病或原发免疫缺陷的婴幼儿造成的疾病更重。rsv感染发病率最高的5个国家贡献了全球近一半的rsv-alrti的疾病负担2。

3、呼吸道合胞病毒(rsv)属于肺炎病毒科，正肺病毒属，非节段性单股负链rna病毒3，根据表面抗原的差异可分为a和b两个亚型4。rsv基因组包括10个基因，编码11种蛋白。其中黏附蛋白g和融合蛋白f是病毒表面的主要保护性抗原，能激起机体产生中和抗体5。g蛋白在亚型间差异性较大，故针对g蛋白的抗体大多是亚型特异的抗体6，而f蛋白在亚型间高度保守，由f蛋白诱导产生的抗体可同时抑制a/b型rsv病毒的感染。

4、f蛋白属于i型跨膜蛋白，其无活性前体(f0)由574个氨基酸组成7，三个f0形成三聚体，在运输通过高尔基体时，宿主的弗林蛋白酶在f0的第109与110位氨基酸之间及136与137位氨基酸之间进行切割。切割后，中间27个氨基酸的短肽(p27)被释放，而其余两段f2及f1通过二硫键连接(cys69–cys212和cys37–cys439)形成具有活性的f蛋白8。在f1蛋白n末端存在有一段高疏水性的融合肽(fusion peptide，fp)，其位于蛋白的疏水腔中而免受外部亲水环境的影响。当f蛋白出现在病毒体表面或细胞表面时，它的结构并不稳定，而是处于一种高能级亚稳态的融合前构象结构(prefusion glyprotein，pre-f)9。随后，f1蛋白的n末端经历了一系列剧烈的结构变化，这个过程诱导了膜融合的发生，从而达到了病毒感染细胞的目的。同时，该过程还导致了f蛋白由高能级亚稳态的pre-f结构转变为稳定的融合后f蛋白结构(postfusion glyprotein，post-f)。

5、目前尚无预防rsv的疫苗，美国食品药品监督管理局批准帕利珠单抗(palivizumab，商品名synagis)用于预防高危婴幼儿感染rsv，需要最多5次注射才能覆盖典型的rsv季节，因费用高昂，不能广泛应用于婴幼儿群体。

6、基于临床需求，开发抗呼吸道合胞病毒抗体对预防rsv感染引起的相关疾病具有重要的医学意义。

技术实现思路

0、发明概述

1、第一方面，本技术提供了针对呼吸道合胞病毒(rsv)的抗体，其包含含hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列的重链可变区和含lcdr1、lcdr2和lcdr3的氨基酸序列的轻链可变区，其中

2、所述hcdr1的氨基酸序列如seq id no:32所示、所述hcdr2的氨基酸序列如seq idno:33所示、所述hcdr3的氨基酸序列如seq id no:34所示，所述lcdr1的氨基酸序列如seqid no:35所示、所述lcdr2的氨基酸序列如seq id no:36所示和所述lcdr3的氨基酸序列如seq id no:37所示；或者

3、所述hcdr1的氨基酸序列如seq id no:38所示、所述hcdr2的氨基酸序列如seq idno:39所示、所述hcdr3的氨基酸序列如seq id no:40所示，所述lcdr1的氨基酸序列如seqid no:41所示、所述lcdr2的氨基酸序列如seq id no:42所示和所述lcdr3的氨基酸序列如seq id no:43所示；

4、其中，hcdr和lcdr氨基酸序列根据kabat定义。

5、在第一方面的一些实施方案中，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如seq id no：28或30所示。

6、在第一方面的一些实施方案中，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：29或31所示。

7、在第一方面的一些实施方案中，所述抗体重链可变区的氨基酸序列如seq id no:28所示，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:29所示；或者

8、所述抗体重链可变区的氨基酸序列如seq id no:30所示，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:31所示。

9、第二方面，本技术提供了针对呼吸道合胞病毒(rsv)的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与seq id no:28或30具有至少90％的同一性，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与seq id no:29或31具有至少90％的同一性。

10、在第一方面和第二方面中任一方面的一些实施方案中，所述抗体为中和性抗体。

11、在第一方面和第二方面中任一方面的一些实施方案中，所述抗体能够结合人呼吸道合胞病毒(rsv)的f蛋白。

12、在第一方面和第二方面中任一方面的一些实施方案中，所述抗体为fab片段、全抗体、f(ab’)2片段或单链fv片段(scfv)。

13、在第一方面和第二方面中任一方面的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。

14、在第一方面和第二方面中任一方面的一些实施方案中，所述抗体包含选自igg1亚型、igg2亚型或igg4亚型的重链恒定区。

15、在第一方面和第二方面中任一方面的一些实施方案中，所述重链恒定区包含igg1亚型重链恒定区的fc段序列并且所述fc段序列的第252，254，256位的氨基酸序列分别为y，t和e，其中所述抗体恒定区氨基酸顺序按照eu numbering来确定。

16、在第一方面和第二方面中任一方面的一些实施方案中，所述抗体包含选自κ亚型或λ亚型的轻链恒定区。

17、第三方面，本技术提供了核酸分子，其编码第一方面或第二方面所述的抗体。

18、第四方面，本技术提供了药物组合物，其包含第一方面或第二方面所述的抗体以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

19、第五方面，本技术提供了第一方面或第二方面所述的抗体、第三方面所述的核酸分子、或者第四方面所述的药物组合物在制备预防或治疗rsv相关疾病的药物的用途。

20、第六方面，本技术提供了预防或治疗rsv相关疾病的方法，其包括向有需要的个体施用第一方面或第二方面所述的抗体、或第四方面所述的药物组合物。

21、第七方面，本技术提供了用于表达抗体fab片段库的质粒组合，其包含第一质粒和第二质粒，其中

22、所述第一质粒包含抗体重链vh-ch1表达单元和第一重组位点；

23、所述第二质粒包含抗体轻链vl-cl表达单元和第二重组位点；并且

24、所述第一重组位点与所述第二重组位点不同。

25、在第七方面的一些实施方案中，所述质粒组合包含多种所述第一质粒，并且多种所述第一质粒携带不同的所述抗体重链vh-ch1表达单元并且具有相同的所述第一重组位点。

26、在第七方面的一些实施方案中，所述质粒组合包含多种所述第二质粒，并且多种所述第二质粒携带不同的所述抗体轻链vl-cl表达单元并且具有相同的所述第二重组位点。

27、在第七方面的一些实施方案中，所述第一质粒和/或所述第二质粒为噬菌粒。

28、在第七方面的一些实施方案中，所述第一质粒和所述第二质粒包含不同的复制原点。

29、在第七方面的一些实施方案中，所述复制原点选自以下中的一种或多种：pbrori、cdf ori、丝状噬菌体m13的复制原点(f1 ori)和p15aori。

30、在第七方面的一些实施方案中，所述第一重组位点和所述第二重组位点分别为噬菌体及其宿主细菌的各自的基因组中用于噬菌体附着的位点。

31、在第七方面的一些实施方案中，所述第一重组位点为attp，所述第二重组位点为attb。

32、在第七方面的一些实施方案中，所述第一重组位点和所述第二重组位点分别位于所述第一质粒和所述第二质粒的多克隆酶切位点处。

33、在第七方面的一些实施方案中，所述抗体轻链恒定区cl为人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区。

34、在第七方面的一些实施方案中，所述抗体重链恒定区ch1段选自igg1、igg2、igg3或者igg4亚型。

35、在第七方面的一些实施方案中，所述第一质粒和/或所述第二质粒包含抗性基因编码区。

36、在第七方面的一些实施方案中，包含编码所述抗体重链恒定区ch1段的核酸分子的3’端融合在编码丝状噬菌体m13的giii蛋白的核酸分子的5’端。

37、在第七方面的一些实施方案中，所述抗性基因为抗生素抗性基因。

38、在第七方面的一些实施方案中，所述抗性基因选自：氯霉素抗性基因(cmr)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)、卡那霉素抗性基因(kar)和四环素抗性基因(tetr)。

39、第八方面，本技术提供了用于表达抗体fab片段库的重组系统，其包含第一质粒、第二质粒和表达噬菌体整合酶的细胞；其中

40、所述第一质粒包含抗体重链vh-ch1表达单元和第一重组位点；

41、所述第二质粒包含抗体轻链vl-cl表达单元和第二重组位点；以及

42、所述第一重组位点与所述第二重组位点不同。

43、在第八方面的一些实施方案中，所述重组系统包含多种所述第一质粒，并且多种所述第一质粒携带不同的所述抗体重链vh-ch1表达单元并且具有相同的所述第一重组位点。

44、在第八方面的一些实施方案中，所述重组系统包含多种所述第二质粒，并且多种所述第二质粒携带不同的所述抗体轻链vl-cl表达单元并且具有相同的所述第二重组位点。

45、在第八方面的一些实施方案中，所述第一质粒和/或所述第二质粒为噬菌粒。

46、在第八方面的一些实施方案中，所述第一质粒和所述第二质粒包含不同的复制原点。

47、在第八方面的一些实施方案中，所述复制原点选自以下中的一种或多种：pbrori、cdf ori、丝状噬菌体m13的复制原点(f1 ori)和p15aori。

48、在第八方面的一些实施方案中，所述第一重组位点和所述第二重组位点分别为噬菌体及其宿主细菌的各自的基因组中用于噬菌体附着的位点。

49、在第八方面的一些实施方案中，所述第一重组位点为attp，所述第二重组位点为attb。

50、在第八方面的一些实施方案中，所述第一重组位点和所述第二重组位点分别位于所述第一质粒和所述第二质粒的多克隆酶切位点处。

51、在第八方面的一些实施方案中，所述抗体轻链恒定区cl为人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区。

52、在第八方面的一些实施方案中，所述抗体重链恒定区ch1段选自igg1、igg2、igg3或者igg4亚型。

53、在第八方面的一些实施方案中，所述第一质粒和/或所述第二质粒包含抗性基因编码区。

54、在第八方面的一些实施方案中，包含编码所述抗体重链恒定区ch1段的核酸分子的3’端融合在编码丝状噬菌体m13的giii蛋白的核酸分子的5’端。

55、在第八方面的一些实施方案中，所述抗性基因为抗生素抗性基因。

56、在第八方面的一些实施方案中，所述抗性基因选自：氯霉素抗性基因(cmr)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)、卡那霉素抗性基因(kar)和四环素抗性基因(tetr)。

57、在第八方面的一些实施方案中，所述噬菌体整合酶为酪氨酸整合酶。

58、在第八方面的一些实施方案中，所述噬菌体整合酶为λ噬菌体整合酶。

59、在第八方面的一些实施方案中，所述噬菌体整合酶为诱导型表达或组成型表达。

60、在第八方面的一些实施方案中，所述噬菌体整合酶为诱导型表达。

61、在第八方面的一些实施方案中，所述表达噬菌体整合酶的细胞为原核细胞。

62、在第八方面的一些实施方案中，所述表达噬菌体整合酶的细胞为大肠杆菌。

63、在第八方面的一些实施方案中，所述表达噬菌体整合酶的细胞为基因工程菌。

64、在第八方面的一些实施方案中，所述第一质粒、第二质粒与所述表达噬菌体整合酶的细胞各自独立存在，或所述第一质粒和第二质粒中至少一者已被引入所述表达噬菌体整合酶的细胞中。

65、第九方面，本技术提供了用于表达抗体fab片段库的重组细胞，其包含第一质粒、第二质粒并且表达噬菌体整合酶；其中

66、所述第一质粒包含抗体重链vh-ch1表达单元和第一重组位点；

67、所述第二质粒包含抗体轻链vl-cl表达单元和第二重组位点；以及

68、所述第一重组位点与所述第二重组位点不同。

69、在第九方面的一些实施方案中，所述重组细胞包含多种所述第一质粒，并且多种所述第一质粒携带不同的所述抗体重链vh-ch1表达单元并且具有相同的所述第一重组位点。

70、在第九方面的一些实施方案中，所述重组细胞包含多种所述第二质粒，并且多种所述第二质粒携带不同的所述抗体轻链vl-cl表达单元并且具有相同的所述第二重组位点。

71、在第九方面的一些实施方案中，所述第一质粒和/或所述第二质粒为噬菌粒。

72、在第九方面的一些实施方案中，所述第一质粒和所述第二质粒包含不同的复制原点。

73、在第九方面的一些实施方案中，所述复制原点选自以下中的一种或多种：pbrori、cdf ori、丝状噬菌体m13的复制原点(f1 ori)和p15aori。

74、在第九方面的一些实施方案中，所述第一重组位点和所述第二重组位点分别为噬菌体及其宿主细菌的各自的基因组中用于噬菌体附着的位点。

75、在第九方面的一些实施方案中，所述第一重组位点为attp，所述第二重组位点为attb。

76、在第九方面的一些实施方案中，所述第一重组位点和所述第二重组位点分别位于所述第一质粒和所述第二质粒的多克隆酶切位点处。

77、在第九方面的一些实施方案中，所述抗体轻链恒定区cl为人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区。

78、在第九方面的一些实施方案中，所述抗体重链恒定区ch1段选自igg1、igg2、igg3或者igg4亚型。

79、在第九方面的一些实施方案中，所述第一质粒和/或所述第二质粒包含抗性基因编码区。

80、在第九方面的一些实施方案中，包含编码所述抗体重链恒定区ch1段的核酸分子的3’端融合在编码丝状噬菌体m13的giii蛋白的核酸分子的5’端。

81、在第九方面的一些实施方案中，所述抗性基因为抗生素抗性基因。

82、在第九方面的一些实施方案中，所述抗性基因选自：氯霉素抗性基因(cmr)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)、卡那霉素抗性基因(kar)和四环素抗性基因(tetr)。

83、在第九方面的一些实施方案中，所述噬菌体整合酶为酪氨酸整合酶。

84、在第九方面的一些实施方案中，所述噬菌体整合酶为λ噬菌体整合酶。

85、在第九方面的一些实施方案中，所述噬菌体整合酶为诱导型表达或组成型表达。

86、在第九方面的一些实施方案中，所述噬菌体整合酶为诱导型表达。

87、在第九方面的一些实施方案中，所述重组细胞为原核细胞。

88、在第九方面的一些实施方案中，所述重组细胞为大肠杆菌。

89、在第九方面的一些实施方案中，所述重组细胞为基因工程菌。

90、第十方面，本技术提供了抗体fab片段库的制备方法，其包括将第一质粒和第二质粒转导入表达噬菌体整合酶的细胞中；其中

91、所述第一质粒包含抗体重链vh-ch1表达单元和第一重组位点；

92、所述第二质粒包含抗体轻链vl-cl表达单元和第二重组位点；以及

93、所述第一重组位点与所述第二重组位点不同。

94、在第十方面所述的一些实施方案中，将多种所述第一质粒转导入所述表达噬菌体整合酶的细胞，其中多种所述第一质粒携带不同的所述抗体重链vh-ch1表达单元并且具有相同的所述第一重组位点。

95、在第十方面所述的一些实施方案中，将多种所述第二质粒转导入所述表达噬菌体整合酶的细胞中，其中多种所述第二质粒携带不同的所述抗体轻链vl-cl表达单元并且具有相同的所述第二重组位点。

96、在第十方面的一些实施方案中，将所述第一质粒和/或所述第二质粒转导入所述表达噬菌体整合酶的细胞中包括以下步骤：

97、(1)将所述第一质粒和/或所述第二质粒转导入感受态细胞中；

98、(2)使用辅助噬菌体感染步骤(1)获得的感受态细胞，以构建噬菌体库；和

99、(3)将步骤(2)获得的噬菌体库转导入所述表达噬菌体整合酶的细胞中。

100、在第十方面的一些实施方案中，所述感受态细胞为原核细胞。

101、在第十方面的一些实施方案中，所述感受态细胞不表达噬菌体整合酶。

102、在第十方面的一些实施方案中，所述辅助噬菌体为m13辅助噬菌体。

103、在第十方面的一些实施方案中，所述第一质粒和/或所述第二质粒为噬菌粒。

104、在第十方面的一些实施方案中，所述第一质粒和所述第二质粒包含不同的复制原点。

105、在第十方面的一些实施方案中，所述复制原点选自以下中的一种或多种：pbrori、cdf ori、丝状噬菌体m13的复制原点(f1 ori)和p15a ori。

106、在第十方面的一些实施方案中，所述第一重组位点和所述第二重组位点分别为噬菌体及其宿主细菌的各自的基因组中用于噬菌体附着的位点。

107、在第十方面的一些实施方案中，所述第一重组位点为attp，所述第二重组位点为attb。

108、在第十方面的一些实施方案中，所述第一重组位点和所述第二重组位点分别位于所述第一质粒和所述第二质粒的多克隆酶切位点处。

109、在第十方面的一些实施方案中，所述抗体轻链恒定区cl为人κ轻链恒定区或人λ轻链恒定区。

110、在第十方面的一些实施方案中，所述抗体重链恒定区ch1段选自igg1、igg2、igg3或者igg4亚型。

111、在第十方面的一些实施方案中，所述第一质粒和/或所述第二质粒包含抗性基因编码区。

112、在第十方面的一些实施方案中，所述抗性基因选自：氯霉素抗性基因(cmr)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)、卡那霉素抗性基因(kar)和四环素抗性基因(tetr)。

113、在第十方面的一些实施方案中，所述噬菌体整合酶为酪氨酸整合酶。

114、在第十方面的一些实施方案中，所述噬菌体整合酶为λ噬菌体整合酶。

115、在第十方面的一些实施方案中，所述噬菌体整合酶为诱导型表达或组成型表达。

116、在第十方面的一些实施方案中，所述噬菌体整合酶为诱导型表达。

117、在第十方面的一些实施方案中，所述表达噬菌体整合酶的细胞为原核细胞。

118、在第十方面的一些实施方案中，所述表达噬菌体整合酶的细胞为大肠杆菌。

119、在第十方面的一些实施方案中，所述表达噬菌体整合酶的细胞为基因工程菌。

120、第十一方面，本技术提供了第七方面所述的质粒组合、第八方面所述的重组系统或第九方面所述的重组细胞在制备抗体fab片段库中的用途。